Circadian Expression and Promoter Analysis of the Zebrafish Period-4 gene

Abstract

In most organisms, light plays a key role in the synchronization of the circadian timing system with the environmental day–night cycle. Light pulses that phase-shift the circadian clock also induce the expression of period genes in vertebrates. Here, we report the cloning of a zebrafish period gene, zfperiod4, which is repressed by light. High amplitude rhythms of zfperiod4 expression are detected under light dark (LD) cycles in zebrafish larvae as well as in the zebrafish cell line PAC-2 that contains a directly light-entrainable clock. The expression of zfperiod4 is detected during the first day of development and we show that the presence of a LD cycle is essential to subsequently establish a robust circadian rhythm in gene expression. We have developed a transient and stable transfection protocol for PAC-2 cells. In this way we have established an in vivo luciferase reporter assay for zfperiod4 expression in this cell line. High-definition bioluminescence traces have enabled us to accurately measure phase-shifting of the clock by light. We have also exploited this model to study how four E-box elements in the zfperiod4 promoter regulate expression. Mutagenesis reveals that the integrity of these four E-boxes is crucial for maintaining low basal expression together with robust rhythmicity and repression by light. In the context of a minimal heterologous promoter, the E-box elements also direct a robust circadian rhythm of expression that is significantly phase-advanced compared with the original zfperiod4 promoter and lacks the light-repression property. These results reveal flexibility in the phase and light responsiveness of E-box-directed rhythmic expression, depending on the promoter context. Finally, a preliminary pharmacological analysis implicates the involvement of the MAP Kinase, cAMP, and PKC signaling pathways in the maintainance of the amplitude as well as entrainment of circadian clock rhythms.

In den meisten Organismen spielt Licht eine Schlüsselrolle bei der Synchronisierung der zirkadianen Zeitgebung mit dem Tag-Nacht Zyklus der Umwelt. Lichtpulse, die eine Phasenverschiebung der Uhr verursachen, induzieren ebenfalls die Expression von period-Genen in Vertebraten. In dieser Arbeit beschreiben wir die Klonierung eines period-Genes des Zebrafisches, zfperiod4, das durch Licht reprimiert wird. Unter einem Licht-Dunkel Zyklus oszilliert die Expression von zfperiod4 mit grosser Amplitude, sowohl in Zebrafischlarven als auch in der Zebrafishzellinie PAC-2, deren Uhr direkt durch Licht synchronisiert werden kann. Die Expression von zfperiod4 beginnt während des ersten Entwicklungstages, und wir zeigen, dass Licht-Dunkel-Zyklen notwendig sind, um einen robust oszillierenden Expressionsrhythmus in den folgenden Tagen zu etablieren. Wir haben ein Protokoll für transiente und stabile Transfektionen der PAC-2-Zellinie entwickelt, was die Herstellung eines in vivo-Luciferase-Reportergensystems für die Expression von zfperiod4 ermöglichte. Die präzisen Biolumineszenzdaten dieses Systems ermöglichten es uns, die Phasenverschiebung der zirkadianen Uhr durch Licht genau zu bestimmen. Wir haben dieses Modell weiterhin benutzt, um zu untersuchen, wie vier “E-box”-Elemente im zfperiod4-Promoter die Expression regulieren. Mutagenese-Experimente haben gezeigt, dass die Vollständigkeit dieser “E-box”-Elemente entscheidend für den Erhalt eines niedrigen basalen Expressionsniveaus sowie für eine robuste Oszillation und die Repression durch Licht sind. Im Kontext eines minimalen heterologen Promotors können die “E-box”-Elemente eine robuste zirkadiane Oszillation steuern, die aber verglichen mit dem ursprünglichen zfperiod4 Promotor deutlich phasenverschoben ist und nicht mehr durch Licht reprimiert werden kann. Diese Ergebnisse zeigen eine Flexibilität in der Phasen- und Lichtempfindlichkeit von “E-Box”-gesteuerter rhythmischer Expression in Abhängigkeit vom Promotorkontext. Schliesslich impliziert eine vorläufige pharmakologische Studie die Signaltransduktionswege der MAP-Kinase, von cAMP und der PKC in der Erhaltung der Amplitude sowie der Synchronisierung der Rhythmen der zirkadianen Uhr.