Identifikation von differentiell exprimierten Genen beim metastasierenden Melanom im Vergleich zum Primärtumor

Abstract

Da die Gendefekte, die zur Metastasierung des malignen Melanoms führen, weiterhin unbekannt sind, und geeignete Zielstrukturen für eine Therapie des Melanoms identifiziert werden müssen, erwächst die Notwendigkeit, weitere Gene zu identifizieren, die im Melanom bzw. in der Metastase spezifische exprimiert bzw. reprimiert werden. Dazu wurden die Methoden der Laser Capture Microdissection, SMART-Kit und die PCR-amplifizierte subtraktive Hybridisierung verwendet. In dieser Arbeit gelang unter Verwendung der Laser Capture Microdissections Methode die Isolierung reiner Melanomzellen aus Primärtumor- bzw. Lymphknotenmetastasen Gewebe für die anschliessende Identifizierung differentiell exprimierter Gene. Durch das Poolen von isolierter RNA aus je vier Primärmelanom bzw. aus je vier Lymphknotenmetastasen können individuelle Expressionsschwankungen ausgeglichen bzw. kompensiert werden. So können Gene identifiziert werden, die bei einer Mehrzahl der Patienten differentiell exprimiert sind. Eine ausreichende cDNA Quantität wurde mit Hilfe des SMART-Kit erreicht, hierbei wird die suffiziente cDNA Menge durch eine long distance PCR gewonnen. Die PCR amplifizierte subtraktive Hybridisierung wurde in zwei verschiedenen Richtungen durchgeführt, d.h. einmal agierten die aus Lymphknotenmetastasen isolierten cDNA’s als Tester und die aus Primärmelanom gewonnen cDNA’s als Treiber. Beim zweiten Ansatz fungierten die aus Primärmelanomen gewonnenen cDNA’s als Tester und die aus Lymphknotenmetastasen isolierten cDNA’s als Treiber. Die PCR-Amplifikate wurden kloniert, und je 320 Klone generiert. Es zeigte sich, dass die Anzahl der differentiell exprimierten Transkripte in Melanomzellen im Vergleich zu denen in Metastasenzellen gering ist. Hingegen waren bei den 320 in den Lymphknotenmetastasenzellen differentiell exprimierten Genen die Anzahl der unterschiedlichen Gene größer. Die Sequenzierung der im Screening bestätigten Klone ergab Gene, die in der Proliferation eine Rolle spielen, ebenso ribosomale und mitochondriale Gene, Transkriptionsfaktoren, Translationsproteine, ein Adhäsionsprotein, ein Signaltransduktionsprotein, ein Transportprotein und Gene, deren Funktion unbekannt ist. Interessante Gene wurden einer einhergehenden Expressionsanalyse mittels Northern Blot unterzogen. Das Expressionsmuster des Laminin Rezeptors 1 wurde zusätzlich über FACS-Analysen, Immunhistologie und in situ Hybridisierungen untersucht.

In order to develop effective treatment strategies for patients with advanced melanoma it is important to gain a better understanding for the underlying mechanism of melanoma development and progression. The main objective was to find molecular targets for the effective treatment of advanced melanoma. For the identification of differentially expressed genes in metastatic melanoma compared to primary melanoma pure tumour cells from frozen tissues by laser capture microdissection were isolated. Subsequently, the RNA was reverse transcribed and the cDNA amplified by SMART (Clontech). Afterwards, PCR-amplified subtractive hybridisation was used to enrich differentially expressed genes in primary melanoma or lymph node metastasis. In total 320 clones from each subtraction was screened by dot blot. Positive clones were sequenced and screened by Northern blot, immunhistochemistry, FACS and in situ hybridisation. The number of differentially expressed genes isolated from metastatic tumour cells was higher than the number of genes isolated from primary tumour cells indication that during progression several genes are activated. Beside ribosomal and mitochondrial genes several genes involved in cell proliferation and transcriptional regulation were found to be differentially expressed in metastatic melanoma cells. Interestingly, several genes with unknown functions which have never been associated with melanoma development were also isolated. Analysis of expression and function of these genes will reveal whether they play a role in melanoma progression.