Formation, distribution, and pathophysiological relevance of the 'advanced glycation end-product' N(epsilon)-(carboxymethyl)-lysine in target tissues of diabetic organ damage and in degenerative and chronic inflammatory tissue lesions

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URI: http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bsz:21-opus-13250
http://hdl.handle.net/10900/48624
Dokumentart: Dissertation
Date: 2004
Language: German
Faculty: 7 Mathematisch-Naturwissenschaftliche Fakultät
Department: Sonstige - Chemie und Pharmazie
Advisor: Voelter, Wolfgang
Day of Oral Examination: 2004-07-20
DDC Classifikation: 540 - Chemistry and allied sciences
Keywords: Carboxymethyllysin , Diabetes mellitus , Oxidativer Stress , Monozyten-Makrophagen-System , Glykation
Other Keywords:
Carboxymethyllysine , diabetes , glycation , oxidative stress , monocyte
License: Publishing license excluding print on demand
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Inhaltszusammenfassung:

Ziel: Untersuchung der Bildung des "advanced glycation endproducts (AGE)" N(epsilon)-(carboxymethyl)-Lysin (CML) in Geweben, Körperflüssigkeiten und zirkulierenden Leukozyten bei Diabetes Mellitus und bei chronisch entzündlichen und degenerativen Erkrankungen. Ferner wurde untersucht, ob CML (a) intrazellulär in Makrophagen und Granulozyten gebildet wird, (b) ein Lipidperoxidationsprodukt darstellt und (c) maßgeblich durch den Einfluß reaktiver Sauerstoffspezies (ROS) entsteht. Ergebnisse: Diabetiker weisen eine um 30 % erhöhte Ausscheidung von CML im Urin auf, bedingt durch eine erhöhte Ausscheidung von CML-Albumin. Immunhistochemisch und mittels Western Blot wurde eine vermehrte Bildung carboxymethylierter Proteine in Nerven- und Muskelgewebe bei Diabetes mellitus und in Knorpel-, Nerven- und Muskelgewebe bei verschiedenen chronisch-entzündlichen und degenerativen Zuständen gefunden. Auffällig war die teilweise intrazelluläre Lokalisation von CML in geweberesidenten Zellen und infiltrierenden Entzündungszellen. Die Kinetik der CML-Bildung und der Beitrag der phagozytären (PHOX) Form der NADPH-Oxidase wurde in monozytären und Mikroglia-Zelllinien untersucht. In stimulierten (PMA 20nM) Mono Mac 6 Zellen wurde eine zeitabhängige CML-Modifikation intrazellulärer Protein innerhalb von 1 - 3 Tagen beobachtet. Diese konnte durch DPI (100mM), einen unspezifischen Inhibitor der NADPH-Oxidase, gehemmt werden. Hemmstoffe der Xanthin-Oxidase (Allopurinol 300mM) oder der NO-Synthase (L-NAME) reduzierten die CML-Bildung nicht. Hemmstoffe der mitochondrialen ROS-Bildung zeigten keinen einheitlichen Effekt auf die CML-Modifikation zellulärer Proteine. Mikrogliale N11 Zellen zeigten eine intrazelluläre CML-Bildung innerhalb von 24 h. Die CML-Bildung war in NADPH-defizienten Mutanten nicht unterdrückt, weder in monozytären PLB (PHOX-defizient) noch in mikroglialen N11/6 Zellen (PHOX-defizient). Zusammenfassung: CML wird in Geweben und intrazellulär in aktivierten monocytären und Mikroglia-Zelllinien gebildet. Durch Untersuchungen mit NADPH-Oxidase defizienten Zelllinien wurde nachgewiesen, daß CML kein spezifischer Marker für die Aktivierung der zellulären NADPH-Oxidase ist.

Abstract:

Aims: To investigate the formation of the advanced glycation end product (AGE) N(epsilon)-(carboxymethyl)-lysine (CML) in tissues, in body fluids, and in circulating blood cells in diabetes mellitus and chronic inflammatory and degenerative diseases. Furthermore, it was tested whether CML is (a) produced intracellularly in macrophages and granulocytes, (b) a product of lipid peroxidation, (c) formed under the influence of reactive oxygen species (ROS). Results: By a sensitive HPLC method it was determined that diabetic patients exhibited a 30 % increase in the urinary excretion of CML mostly due to an increase of CML-albumin. By immunohistochemistry (IHC) and Western blot techniques, an increase in the formation of CML-modified proteins in nerve tissue, muscle tissue and cartilage tissue has been found in diabetics and in various chronic inflammatory and degenerative conditions. A common feature was the intracellular localisation of CML accumulation in resident and infiltrating inflammatory cells. The kinetic of CML formation and the contribution of the phagocytic (PHOX) form of NADPH oxidase was analysed in monocytic and neuroglial cell lines. In stimulated (PMA 20nM) Mono Mac 6 cells, a time-dependent CML modification of intracellular proteins was observed within 1-3 days. This effect could be blocked by DPI (100mM), an unspecific inhibitor of NADPH oxidase. Inhibitors of xanthine oxidase (allopurinol 300mM) or of NO-Synthase (L-NAME) had no effect. The effects of various inhibitors of mitochondrial ROS production were not conclusive. N11 cells showed CML-formation within 24 h. CML formation was not reduced in NADPH oxidase deficient mutants, neither in monocytic PLB (PHOX-deficient) nor in microglial N11/6 cells (PHOX-deficient). Conclusion: In summary, it has been demonstrated that CML is formed in tissues and in activated monocytes. The observed CML modification of cellular proteins is independent of NADPH oxidase or xanthine oxidase. The direct or indirect inhibition of mitochondrial ROS production does not lead to a general reduction of CML formation. Other unidentified sources of reactive oxygen species or different mechanisms appear to be responsible for the formation of CML.

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