Untersuchungen zur RNA-Rekombination beim Virus der bovinen viralen Diarrhö – Einfluss einer zellulären Insertion auf die virale Polyproteinprozessierung und Zytopathogenität

Abstract

BVDV ist dafür bekannt, dass zythopathogene Virusvarianten durch Integration zellulärer Sequenzen in das virale RNA-Genom entstehen. Die zellulären Insertionen induzieren nach Translation eine zusätzliche Spaltung des viralen Polyproteins. In der vorliegenden Arbeit wurden die Genome von verschiedenen BVDV Isolaten charakterisiert, die alle aus einem erkrankten Tier stammen. Analysen von cDNA-Klonen und RT-PCR Fragmenten erlaubten es, die Genomstrukturen einer Reihe von Viren zu rekonstruieren. Alle enthielten die gleiche zelluläre Sequenz, flankiert von unterschiedlich rearrangierten viralen Sequenzen. Die gefundenen Genomstrukturen lassen sich auf eine Grundstruktur zurückführen. Da die Entstehung solcher Virusvarianten mit weitgehend übereinstimmenden Genomstrukturen in unabhängigen Rekombinationsereignissen unwahrscheinlich ist, deuten diese Ergebnisse auf einen evolutionären Prozess hin, in dem eine Primärrekombinante gebildet und anschliessend durch weitere Rekombinationen verändert wurde. Bei der zellulären Insertion handelt es sich um ein Fragment des LC3 („light chain 3“), einem Bestandteil von Mikrotubuli assoziierten Proteinen. Aufgrund früherer Befunde war zu erwarten, dass das LC3 im viralen Polyprotein als Signal für eine proteolytische Prozessierung dient. Dies konnte in proteinbiochemischen Analysen bestätigt werden. Mutageneseexperimente erlaubten die Charakterisierung der Spaltstelle, die direkt am caroxyterminalen Ende der zellulären Insertion lokalisiert ist. In in vitro-Translationsstudien mit verschiedenen Proteaseinhibitoren konnte zudem gezeigt werden, dass es sich bei der prozessierenden Protease vermutlich um eine Cysteinprotease handelt. Expressionen in Zellen verschiedener Spezies zeigten, dass das prozessierende System außergewöhnlich gut konserviert ist, denn in Zellen von Hamster, Huhn, Fisch und Moskito wurde das bovine Substrat offensichtlich authentisch gespalten. LC3 bzw. das homologe Protein Aut7p/Apg8p der Hefe besitzen wesentliche Funktionen bei der Autophagie von hungernden Zellen. LC3 und Aut7p/Apg8p werden dazu durch carboxyterminale Proteasespaltung aktiviert. Nach Klonierung verschiedener potentieller Proteasegene aus Rinderzellen konnte durch in vitro-Kotranslationen und Expressions-Experimente in Hefezellen gezeigt werden, dass eine der potentiellen Proteasen tatsächlich LC3 prozessiert. Die Expression dieser und einer weiteren potentiellen Rinderprotease in Hefezellmutanten konnte eine Mutation, die zum Verlust der spezifischen Hefeprotease Aut2p/Apg4p führte, komplementieren. Die vorliegende Arbeit hat damit wichtige Erkenntnisse sowohl über die Grundlagen der Zytopathogenität von BVDV und die Entwicklung der MD als auch über ein hochkonserviertes zelluläres Protein-Prozessierungssystem erbracht.

The bovine viral diarrhea virus (BVDV) is known for the ability to integrate cellular sequences into its viral RNA genome, resulting in cytopathogenic (cp) variants of the virus. After translation, the cellular insertions induce an additional cleavage of the viral polyprotein. In this thesis the genomes of different BVDV isolates obtained from a single infected animal were characterized. The sequence analysis of cDNA clones and of RT-PCR fragments allowed the reconstruction of the genome structures of a set of viruses. All of them contained the identical cellular sequence, flanked by variable rearranged viral sequences. The genomes of the different virus variants had closely related structures, making it likely that in the animal a primary recombinant virus arose, that was subsequently changed by further recombination events. The cellular insertion is a fragment of light chain 3 (LC3), a module of microtubule-associated proteins. As expected, LC3 was shown to serve as a signal for proteolytic processing. The cleavage site was identified directly at the carboxyterminus of the cellular insertion by mutagenesis experiments. In vitro-translation studies with different protease inhibitors indicated that the processing likely occurs by a cystein protease of the animal host. The expression of viral polyprotein in cells of hamster, chicken, fish, and mosquito revealed that the processing system is unusually well conserved LC3 and the homologous protein Aut7p/Apg8p from yeast have essential functions in autophagy of starving cells. For this, LC3 and Aut7p/Apg8p are activated by carboxyterminal protease cleavage. One protease from bovine cells bAut2B2 was identified that was capable of processing LC3 upon in vitro cotranslation and expression in yeast cells. The expression of bAut2B2 and bAut2A another potential bovine protease could complement a yeast mutant strain defective in the specific protease Aut2p/Apg4p. In summary, these results (1) give important insights into mechanism of cytopathogenity of BVDV and the subsequent development of mucosal disease (MD) and (2) lead to the identification of a highly conserved cellular protein processing system.