Legionella pneumophila - intrazelluläre Propagierung des LPS und Assoziation des Phagosoms mit dem endoplasmatischen Retikulum während der intrazellulären Vermehrung in humanen Monozyten

Abstract

Da das LPS von L. pneumophila Sg 1 keine klassische Endotoxinfunktion aufweist und einen ungewöhnlichen strukturellen Aufbau hat, übernimmt diese Molekül mit großer Wahrscheinlichkeit andere Funktionen, wie beispielsweise Interaktion mit Wirtszellmembranen, die im Rahmen der vorliegenden Arbeit mittels Immunogoldmarkierungen herausgearbeitet werden sollten. Ein weiteres Ziel war es, die zeitlichen Abläufe, denen die Rekrutierung von endoplasmatischen Retikulum zu L. pneumophila-Phagosomen unterliegt, mit Hilfe konventioneller Elektronenmikroskopie genauer zu untersuchen, da hierfür bis dato nur spärliche Daten vorliegen. Zur Erfassung der LPS-Synthese dienten RT-PCR Studien mit acht daran beteiligten Genen. Es zeigte sich, dass sich das LPS von internalisierten Bakterien ablöste und an inneren Phagosomenmembranen ansammelte. Darüber hinaus war auch eine intrazelluläre Prozessierung dieses Moleküls in das Zytoplasma der Wirtszellen nachzuweisen. Weiterhin konnte gezeigt werden, dass die Rekrutierung des endoplasmatischen Retikulums zu L. pneumophila enthaltenden Phagosomen in zwei sich wiederholenden Zyklen verlief. Des Weiteren unterlag die LPS-Synthese in intrazellulären Legionellen einer Regulation, wohingegen die LPS-Synthese nicht reguliert war, wenn die Bakterien extrazellulär replizierten. Erste Versuche machten deutlich, dass dem LPS für das intrazelluläre Überleben wahrscheinlich eine essentielle Funktion zukommt, da Legionellen, die nur sehr geringe Mengen an LPS aufwiesen, nicht zur intrazellulären Replikation befähigt waren.

In comparison to lipopolysaccharides of other gram-negative bacteria, the L. pneumophila-LPS has a different and unique structure. Due to high levels of long branched fatty acids and elevated levels of O- and N-acetyl groups, this LPS is highly hydrophobic. Additionally, this type of LPS does not function as a classical endotoxin. Therefore, other possible functions, such as integration into host cell membranes during intracellular replication remain to be investigated. Additionally, the kinetics regarding recruitment of endoplasmic reticulum towards L. pneumophila containing phagosomes were determined since such data is not complete yet. Following a complete infection cycle, we could elucidate by electron microscopy a biphasic traffick of endoplasmic reticulum towards the phagosomes. Performing immunogold labeling, we also observed remarkable intracellular traffic of L. pneumophila-LPS during intracellular multiplication within human monocytes as well as shedding of LPS from bacterial surfaces towards phagosomal membranes. Additionally, intracellular processing of LPS across the cytoplasm could be observed. Furthermore, time-dependent regulation of LPS content could be detected. To further elucidate the intracellular fate of L. pneumophila-LPS, genes coding for LPS synthesis and LPS transport were investigated on mRNA level by RT-PCR. These studies revealed intracellular regulation, whereas no regulation occurred in extracellularly broth cultivated Legionella bacteria. Since Legionella bacteria exposing low levels of LPS were not able to multiply intracellularly, the LPS is likely to be an essential factor to guarantee intracellular survival.