A peptide-conjugate vaccine against measles

Abstract

Today there is a large consensus that the development of new measles vaccines cannot wait until in the final stage of an eventual WHO measles elimination program when its need will become urgent. Strategies for vaccination during early infancy and revaccination of adults include peptide based conjugate and recombinant polyepitope vaccines for potentially non-invasive routes of administration such as the nose or the skin. The inclusion of peptide-based antigens in an experimental subunit vaccine implies the careful evaluation of its structural characteristics and the biological significance thereof. Although peptides are conformationally very unstable, studies of antigenicity and immunogenicity paired with molecular modeling iteratively shape the understanding of peptide-antibody interactions.

Neutralizing and protective monoclonal antibodies (mAbs) were used to fine-map the highly conserved hemagglutinin noose epitope (H379-410, HNE) of the measles virus. Short peptides mimicking this epitope were previously shown to induce virus-neutralizing antibodies. The epitope contains three cysteine residues, two of which (Cys386 and Cys394) form a disulfide bridge critical for antibody binding. Substitution and truncation analogues revealed four residues critical for binding (Lys387, Gly388, Gln391 and Glu395) and suggested the binding motif X7C[KR]GX[AINQ]QX2CEX5 for three distinct protective mAbs. This motif was found in more than 90% of the circulating wild-type measles viruses and its presence in wild-type strains correlates with their neutralization by anti-HNE mAbs. An independent molecular model of the core epitope predicted an amphiphilic loop displaying a remarkably stable and rigid loop conformation. The three hydrophilic contact residues Lys387, Gln391 and Glu395 pointed on the virus towards the solvent-exposed side of the planar loop and the permissive hydrophobic residues Ile390, Ala392 and Leu393 towards the solvent-hidden side of the loop, precluding antibody binding. The high affinity (Kd = 7.60 nM) of the mAb BH216 for the peptide suggests a high structural resemblance of the peptide with the natural epitope and indicates that most interactions with the protein are also contributed by the peptide. Improved peptides designed on the basis of these findings induced sera that crossreacted with the native measles virus hemagglutinin protein and protected against an intracranial challenge with a rodent-neuroadapted MV strain. Interestingly, and targeted the same critical residues as defined in the HNE binding motif, although with less stringency than the mAbs. Stable backbone conformation and side chain orientation of critical contact residues is essential for reliable crossreactive immunogenicity.

For successful inclusion of a peptide-conjugate in vaccine formulations and schedules designed for early infancy, its peptide-specific immunogenicity has to be evaluated carefully in the presence of prior immunity or passively acquired antibodies against the carrier protein as both factors are known to interfere often with subsequent infant immunization, although with changing degrees of clinical incidence. In addition, its compatibility with a succeeding administration with the live attenuated virus has to be assessed.

Mice pre-immunized with the free carrier proteins diphtheria toxoid or tetanus toxoid developed after two succeeding injections with the peptide-conjugate similar protective antibody levels against the peptide than animals without prior immunization with the carrier protein. As expected, no epitopic suppression of the anti-peptide response occurred, presumably because of efficient activation of carrier-specific T cells. However, passive transfer of anti-carrier or anti-peptide conjugate antibodies decreased peptide-specific antibody titers significantly and the antibody response against the homologous carrier protein was also reduced. Nonetheless, the suppressive effect of passive antibodies can be overcome by additional boosting. These results confirm previous studies pointing out that the response to a hapten is enhanced after active priming with the carrier protein and that the hapten-specific antibody response is mainly suppressed by passively acquired antibodies. These findings stress the importance of the memory T-cell immunity for the immunogenicity of peptide-conjugate vaccines, as carrier-specific CD4+ helper cells govern the activation and clonal expansion of peptide- and carrier-specific B cells. Moreover, prior antibodies against the HNE epitope does not preclude an efficient active antibody response against other epitopes of the MV, underlining thus that a immunization with a peptide-conjugate is compatible with a subsequent administration of the live attenuated measles vaccine.

Peptide-conjugates induce also high titers of protective antibodies after intranasal administration. Moreover, peptide-conjugates efficiently induced peptide-specific antibodies after application on shaved, intact skin. Needle-free delivery of a peptide-conjugate vaccine against measles via non-invasive routes such as the nose or the bare skin would largely increase its safety and compliancy for early infancy use. An intranasal spray or a transcutaneous administration via a patch would be compatible with self-administration and would thus represent a major advantage for revaccination of adults with waning immunity to measles.

Es besteht heute ein breiter Konsens, dass die Entwicklung eines neuen Impfstoffs gegen Masern nicht bis zur Endphase eines potentiellen Eliminierungsprogramms der WHO aufgeschoben werden kann, wenn sein Einsatz unmittelbar dringend wird. Impfstrategien für die frühe Kindheit und das Revakzinieren von Erwachsenen sehen den Gebrauch von Peptidkonjugat- und rekombinanten Polyepitopvakzinen vor, welche unter anderem auch für nicht-invasive Verabreichungswege wie die Nase oder die Haut ausgelegt sind. Obwohl Peptide aus konformationeller Sicht sehr unstabile Gebilde sind, können Antigenizitäts- und Immunogenizitätsstudien, unterstützt durch molekulare Modellisierungsalgorithmen, viel zum Verständnis von Peptid-Antikörper-Wechselwirkungen beitragen.

Neutralisierende und protektive monoklonale Antikörper wurden benutzt für die Feinkartierung des konservierten Hemagglutinin Noose Epitop (H379-410, HNE) des Masernvirus. Es konnte in früheren Arbeiten gezeigt werden, dass kurze Peptidmimetika dieses Epitops neutralisierende Antikörper induzieren. Das Epitop enthält drei Cysteinreste, von denen zwei (Cys386 und Cys394) eine Disulfid-Brücke bilden, welche ausschlaggebend für die Antikörperbindung ist. Mit Hilfe einer Bibliothek, bestehend aus substituierten und verkürzten Epitopanaloga, konnten 4 Aminosäurereste (Lys387, Gly388, Gln391 und Glu395) eingegrenzt werden, welche kritisch für die Wechselwirkung sind und im Bindungsmotif X7C[KR]GX[AINQ]QX2CEX5 für 3 unterschiedliche protektive Antikörper definiert werden. Dieses Motif kommt in mehr als 90% der zirkulierenden Widtypviren vor und dessen Präsenz im Wildtypstamm korreliert mit Virusneutralisation durch monoklonale HNE-spezifische Antikörper. Unabhängig davon wurde die Konformation der Epitopkernsequenz mit Hilfe von Modellisierungsalgorithmen berechnet und eine amphiphile Schleife mit aussergewöhnlich stabiler und verwindungssteifer Struktur wurde gefunden. Die 3 hydrophilen Kontaktreste Lys387, Gln391 und Glu395 befinden sich an der exponierten Oberfläche der kompakten, platten Epitopschleife auf dem Virusprotein im Gegensatz zu den ersetzbaren, hydrophoben Resten Ile390, Ala392 und Leu393, welche auf der wasserunzugänglichen Seite zu finden und für die Antikörperwechselwirkungen nicht zu erreichen sind. Die hohe Affinität (Kd = 7.60 nM) des monoklonalen Antikörpers BH216 für das Peptid weist auf eine hohe Übereinstimmung mit der Originalstruktur des Epitops auf dem H-Protein hin und bedeutet, dass die meisten Antikörperwechselwirkungen im Proteinepitop auch im Peptidepitop stattfinden. Optimisierte Peptidepitopsequenzen konnten in ein Peptidkonjugat implementiert werden und induzierten Antikörper welche mit dem nativen Masern-H-Protein kreuzreagierten und in einem Mausmodell gegen eine lethale Infektion mit einem neuroadaptierten Masernvirus schützten.

Eine erfolgreiche Entwicklung eines Peptidimpfstoffes und dessen dazugehörigen Immunisierungszeitplan für das frühe Kindesalter setzt eine sorgfältige Auswertung der peptidspezifischen Immunogenizität bei bestehender Immunität oder passiv erworbener Antikörper gegen das Trägerprotein im Konjugat voraus. Es ist bekannt, dass beide Faktoren eine humorale Antwort entschieden beeinflussen, obgleich in variierendem Masse an klinischer Signifikanz. Darüber hinaus sollte gewährleistet werden, dass mehrere Immunisierungen mit einem Peptidkonjugat kompatibel sind mit einer späteren Vakzinierung mit dem Lebendmasernimpfstoff.

Nach zwei Injektionen mit einem Peptidkonjugat, basierend auf Diphtheria- oder Tetanus-Toxoid als Trägerprotein, entwickelten Mäuse gleiche peptid- und trägerspezifische Antikörpertiter, unabhängig von einer vorherigen aktiven Immunisierung mit dem Trägerprotein. Wie erwartet, findet keine sogenannte epitopische Suppression statt; vermutlich wegen einer vorherigen effizienten Aktivierung einer trägerspezifischen T-Zell Antwort. Die Päsenz passiver peptid- oder trägerspezifischer Antikörper hemmte jedoch eine humorale Antwort sowohl gegen das Peptid wie auch gegen das Trägerprotein in unspezifischer Weise, aber in einem Umfang abhängig von der Dosis der passiven Antikörper. Nichtsdestotrotz kann dieser suppressive Effekt durch zusätzliche Booster-Injektionen überwunden werden. Diese Resulte stimmen mit vorherigen Studien überein, welche einerseits die stimulierende Rolle einer vorherigen aktiver Trägerimmunisierung hervorheben und andererseits eine Inhibition einer Antikörper Antwort hauptsächlich auf die Präsenz passiver Antikörper zurückführen. Die Resultate aus unserer Studie unterstreichen die Wichtigkeit von vorhandenen Memory-T-Zellen für die Immunogenizität in Peptidkonjugatimpfstoffen, da trägerspezifische CD4+ Helferzellen die Aktivierung und die klonale Expansion von peptid- und trägerspezifischen B-Zellen steuern. Darüber hinaus konnte gezeigt werden, dass peptidspezifische Antikörper die Induktion von Antikörper gegen andere Masernepitope nicht inhibiert, was soviel bedeutet wie, dass eine vorherige Immunisierung mit Peptidkonjugat tatsächlich kompatibel ist mit einer darauffolgenden Injektion mit Lebendimpfstoff.

Nicht nur in einer intraperitonealen, sondern auch in einer intranasalen Verabreichung induzierten diese Peptidkonjugate hohe und protektive peptidspezifische Antikörpertiter. Überdies waren diese Konjugate in der Lage nach einfacher Applikation auf intakte, rasierte Haut gute peptidspezifische Antikörpertiter zu induzieren. Eine spritzenfreie Verabreichung auf nicht-invasiven Wegen - wie in diesem Fall die Nase oder die nackte Haut - würde die Sicherheit und die Akzeptanz von Peptidimpfstoffen für die frühe Kindheit entscheidend vergrössern. Ein nasaler Spray oder die transkutaneale Aufbringung durch ein Pflaster wären für eine Selbstverabreichung gut geeignet und würden auch eine Möglichkeit bieten zur Revakzinierung von Erwachsen mit schwindender Masernimmunität.