Charakterisierung von organischen Stickstofftransport im Ektomykorrhizapilz Hebeloma cylindrosporum

Abstract

Ektomykorrhizen haben in borealen Nadelwäldern und temperierten Laubwäldern der Nordhemisphäre eine entscheidene Aufgabe in der Versorgung ihrer pflanzlichen Partner mit Stickstoff, der wichtigste wachstumslimitierende Nährstoff. In diesen Waldböden ist Stickstoff hauptsächlich in organischen Verbindungen vorhanden, welche nicht für die Pflanze, aber für den Ektomykorrhizapilz verwertbar sind. Die mit der Pflanze in Symbiose lebenden Pilze können mit Hilfe von extrazellulären Proteinasen Proteine in diesen Böden spalten. Dies ermöglicht dem Pilz organischen Stickstoff in Form von freien Aminosäuren und Peptiden aufzunehmen, zu assimilieren und schliesslich (zum Teil) an die Pflanze abzugeben. Da der Ektomykorrhizapilz einen wichtigen Beitrag zur Stickstoffversorgung für die mit ihm assoziierten Pflanze leistet, ist es von Bedeutung, die Aufnahmemechanismen von organischen Stickstoff vom Boden in den Pilz (und schliesslich Transport in die Pflanze) und deren Regulation zu verstehen. Um Transporter zu identifizieren, die an der Aufnahme von organischen Stickstoffverbindungen aus dem Boden in die Pilzhyphen bzw. am Transport vom Pilz in die Pflanze, beteiligt sind wurde eine cDNA Bibliothek vom Myzel des Ektomykorrhizapilzes Hebeloma cylindrosporum hergestellt. In dieser Arbeit wurde die Qualität dieser Bibliothek getestet, indem ca. 500 ESTs sequenziert wurden und damit eine Sequenzdatenbank für den Modellorganismus H. cylindrosporum hergestellt (www.uni-tuebingen.de/plantphys /hebeloma/index.html). Von dieser cDNA Bibliothek wurde ein Gen, das für einen Aminosäuretransporter (HcGAP1) kodiert isoliert und charakterisiert. Zusätzlich wurden zwei Peptidtransporter (HcPTR2A, -B) charakterisiert. Die Analyse dieser Transporter durch Aufnahmeexperimenten zeigt, das sie am Import von organischen Stickstoffverbindungen beteiligt sind. Weiterhin konnte durch Expressionsstudien gezeigt werden, dass diese Transporter durch verschiedene Stickstoffquellen reguliert werden. Da extrazelluläre Proteinasen eine wichtige Rolle für die Verfügbarkeit von organischen Stickstoff für den Pilz bzw die Pflanze spielen, wurde die Proteaseaktivität von Hebeloma getestet und ein Gen das möglicherweise für eine Proteinase kodiert isoliert. Schliesslich wurde eine Methode zur Transformation von Hebeloma via Agrobakterium tumefaciens etabliert.

Ectomycorrhizal trees dominate boreal and temperate forest ecosystems in which nitrogen is generally accepted to be the most important growth-limiting nutrient. In these forest soils nitrogen is mainly available as organic compounds which are not accessible to plants but to the ectomycorrhizal fungi. The fungal partners are able to break down proteins present in these soils by using extracellular proteinase. Thus, they can take up and assimilate organic nitrogen in the form of free amino acids and peptides which can then be transferred to the plant. Since ectomycorrhizal fungi strongly participate in nitrogen nutrition of the plant in these soils, it is necessary to understand uptake of organic nitrogen from the soil by the fungus (its subsequent transport to the plant) and its regulation. To identify the transporters involved in the uptake of organic nitrogen compounds by the fungal hyphae and their transfer to the plant, it was necessary to develop genomic tools. An oriented expression library was constructed from the mycelia of the ectomycorrhizal fungus Hebeloma cylindrosporum. In this work, the quality of this library was tested by DNA sequencing of ~500 ESTs and a sequence database was generated for the model fungus H. cylindrosporum (www.uni-tuebingen.de/plantphys/hebeloma/index.html). Furthermore the suitability of the library to identify Hebeloma genes via their function was demonstrated. Using Hebeloma cDNA libraries a gene encoding for an amino acid transporter (HcGAP1) was isolated and characterized. Two peptide transporters (HcPTR2A, -B) were also characterized. The characterization of these transporters by uptake experiments shows that they play a role in the import of organic nitrogen compounds into Hebeloma. Expression studies demonstrated that these transporters are regulated by different nitrogen sources. As extracellular proteinases play an important role in organic nitrogen availability, the proteinase activity of Hebeloma was characterized and a gene encoding for a putative extracellular proteinase was isolated. Finally, a method for Agrobacterium tumefaciens mediated transformation of Hebeloma was successfully established.