Genetische Defekte im renalen Cystintransport und ihre Bedeutung für die Cystinurie

Abstract

Die Cystinurie beruht auf einer Störung des transepithelialen Transports von Cystin und den dibasischen Aminosäuren Ornithin, Lysin und Arginin im proximalen Nierentubulus. Die verminderte Rückresorption der Aminosäuren sowie die geringe Löslichkeit des Cystins im Urin resultieren in der rezidivierenden Bildung von Nierensteinen.

Die Cystinurie ist eine der häufigsten genetischen Erkrankungen, die Prävalenz liegt bei ca. 1:7.000. Unter allen Nierensteinerkrankungen macht die Cystinurie ca. 1-2 % aus.

Derzeit wird die Erkrankung anhand der Cystin-Konzentrationen im Urin heterozygoter Anlageträger in zwei Typen unterteilt. Die Typ I-Cystinurie wird hauptsächlich durch Mutationen im SLC3A1-Gen verursacht, während die nicht-Typ I-Cystinurie durch Mutationen im SLC7A9-Gen bedingt ist. Beide Gene kodieren für jeweils eine Untereinheit des heterodimeren Aminosäuretransporters rBAT/b0,+AT, der in der apikalen Membran der Nierenepithelzellen lokalisiert ist.

Für die vorliegenden Studien standen 25 neu eingesandte Patienten und Probanden zur Verfügung. Ausgewählte Analysen wurden auf das ethnisch gemischte Gesamtkollektiv von 84 Patienten ausgeweitet. Ein Teil dieses Kollektivs wurde bereits in vorhergehenden Arbeiten beschrieben.

Die zentrale Fragestellung der vorliegenden Arbeit lautete, inwieweit verschiedene Mutationstypen in den bekannten Genen (Deletionen, Duplikationen, Mutationen in der Promoter-Region) und weiteren Kandidatengenen an der Entstehung der Erkrankung beteiligt sind.

Um das Patientenkollektiv auf Deletionen und Duplikationen in den Genen SLC3A1 und SLC7A9 hin untersuchen zu können, wurde hier das Verfahren der quantitativen real-time PCR etabliert. Im SLC3A1-Gen konnte so erstmals eine große Duplikation detektiert werden. Im quantitativ bisher nicht untersuchten SLC7A9-Gen lagen größere Deletionen vor.

Mittels Kopplungsstudien sollte geklärt werden, ob weitere Gene an der Erkrankung beteiligt sind. Hierzu wurden Familien analysiert, bei denen bisher keine Mutationen in bekannten Genen detektiert werden konnten. Ausgesuchte Kandidatengene wurden mittels direkter Sequenzierung analysiert. Dabei konnten keine Mutationen identifiziert werden.

Um die klinische Diagnose der Cystinurie molekulargenetisch zu sichern, sollte ein diagnostisches Schema erstellt werden, anhand dessen eine Vielzahl der häufigen Mutationen schnell und kostengünstig bestimmt werden kann. Insgesamt konnten mittels der in dieser Studie etablierten und angewandten Methoden bei 78,75 % aller Patienten Mutationen detektiert werden, es konnten 63,41 % der Allele erklärt werden. Die Detektionsrate für Mutationen in den Genen SLC3A1 und SLC7A9 konnte so retrospektiv von 53,66 % auf 63,41 % der Allele erhöht werden.

Im weiteren Teil der Arbeit wurde die Auswirkung einzelner Polymorphismen im SLC7A9-Gen auf die Ätiologie der Erkrankung untersucht. In Ergänzung zu bereits durchgeführten Analysen wurden in der vorliegenden Arbeit die Allel- und Genotypfrequenzen in einem einheitlichen Patienten- und Kontrollkollektiv analysiert. Bei einzelnen Polymorphismen wurde ein statistisch signifikant unterschiedliches Verteilungsmuster der Allele und Genotypen unter Patienten und Kontrollen festgestellt. Um den möglichen funktionellen Charakter dieser Varianten zu untersuchen, wurden Spleißanalysen in COS7-Zellen durchgeführt. Dazu wurden Minigene-Konstrukte hergestellt, die in den Zellen exprimiert und anschließend auf cDNA-Ebene untersucht wurden. Dabei zeigte sich, dass einzelne Varianten unterschiedliche Spleißvarianten hervorrufen, die möglicherweise eine regulatorische Funktion im Hinblick auf die Expression des Genprodukts besitzen und so zu einem variablen klinischen Erscheinungsbild führen könnten.

Zusammenfassend zeigen diese Daten, dass verschiedene Mutationstypen und Varianten in den Genen SLC3A1 und SLC7A9 eine grundlegende Bedeutung für die Ätiologie der Cystinurie haben. Im eigenen Kollektiv ergab sich kein Hinweis auf die Beteiligung weiterer spezifischer genetischer Faktoren auf die Pathogenese der Erkrankung, inwieweit modifizierende Faktoren eine Rolle spielen bleibt abzuwarten.

Cystinuria is characterized by a defect transepithelial transport of cystine and the dibasic amino acids ornithine, lysine and arginine in the proximal renal tubules. The decreased reabsorption and the low solubility of cystine in the urine results in recurrent formation of kidney stones associated with different complications.

Cystinuria is one of the most common genetic diseases with a prevalence of 1:7.00. Among all kidney stone diseases cystinuria accounts for 1-2 %.

At the moment the disease is classified in two types by means of measuring the cystine concentration in urine of heterozygous carriers. Type I-cystinuria is mainly caused by mutations in the SLC3A1-gene, while the non-type I-cystinuria is caused by mutations in the SLC7A9-gene. Both genes encode a subunit of the heterodimeric amino acid transporter rBAT/b0,+AT localized in the apical membrane of renal epithelia cells.

In the present study 25 new patients and probands were available. Selected analyses were extended on the ethnically mixed study cohort of 84 patients and probands. A part of this cohort was described in previous studies.

The goal of this work was to determine, which different types of mutations in the known genes (deletions, duplications, mutations in the promoter region) and in further candidate genes are involved in the development of the disease.

To analyze the patient cohort for deletions and duplications in the genes SLC3A1 and SLC7A9 that can not be detected by conventional mutation screening methods, assays for real-time PCR were established. In the SLC3A1 gene a large duplication could be identified, in the SLC7A9 gene, which was not analyzed quantitatively before, large deletions could be detected in three patients.

Linkage analysis should show whether further genes are involved in the disease. Therefore families without mutations in the known genes were analyzed. Selected candidate genes were screened by direct sequencing. However, no mutations could be identified.

To ensure the clinical diagnosis of cystinuria on the molecular genetic level, a diagnostic scheme was established delineated from the frequency of single mutations. Thereby most of the common mutation could be detected fast and cost-saving. Thereby a high percentage of mutations could be detected without performing an extensive screening in both genes. In total, in 78,75 % of all patients mutations could be detected by the methods established and applied in this study; 63,41 % of all alleles could be determined. The detection rate for mutations in the genes SLC3A1 and SLC7A9 could retrospectively be increased from 53,66 % to 63,41 % of the alleles.

In a further part of the work the effect of single polymorphisms in the SLC7A9 gene on the etiology of the disease was tested. In addition to previously performed studies, in the present work the allele and genotype distribution was determined in a consistent patient and control group. Starting from the statistically significant different distribution of single polymorphisms in patients and controls the functional consequence of single variants for splicing were performed in COS7 cells. Minigenes were created, expressed in cells and analyzed on cDNA level. Thereby it could be demonstrated, that single variants induce different splice variants with a possible regulatory function for the expression of the gene product, potentially leading to a variable clinical phenotype.

In conclusion, these data show that different types of mutations and variants in the genes SLC3A1 and SLC7A9 have an essential relevance for the etiology of cystinuria. In the cohort analyzed in this study there was no hint for the involvement of other specific genetic factors in the pathogenesis of the disease. It has to be determined to what extent modifying factor play a role in cystinuria.