T- und B-Zellepitope von Glykoproteinen des Pseudorabiesvirus (Suid Herpesvirus 1)

Abstract

Das Pseudorabiesvirus (PRV) ist der Verursacher der Aujeszky'schen Krankheit beim Schwein, die zu starken finanziellen Einbußen in der Landwirtschaft führt. Die zur Verfügung stehenden Impfstoffe erfüllen nicht die Bedingungen für einen idealen Impfstoff. An der Entwicklung neuer Impfstoffe gegen PRV wird gearbeitet. Die PRV-Glykoproteine spielen eine wichtige Rolle bei der Generierung einer protektiven Immunität gegen PRV. Deshalb galt die vorliegende Arbeit der Identifizierung von T- und B-Zellepitopen pseudorabiesviraler Glykoproteine. Ein Schwerpunkt der Arbeit lag bei der T- und B-Zellepitopkartierung des Glykoproteins gD. Zunächst wurden im bakteriellen Expressionssystem pEV40 drei gD-Fusionsproteine hergestellt: GD (gD AS 1-402), welches das gesamte Glykoprotein gD repräsentierte, GD-1 (GD AS 1-170) für den N-terminalen und GD-2 (gD AS 170-402) für den C-terminalen gD-Anteil. Diese sollten zur näheren Eingrenzung von B- oder T-Zellepitopen in Western-Blot-Analysen mit PRV-spezifischen Seren oder in Proliferationstests mit PRV-immunen PBMC eingesetzt werden. Das bakterielle Expressionssystem pEV40 erwies sich zur Expression der gD-Fusionsproteine jedoch als nur bedingt geeignet. Alle drei Fusionsproteine wurden nur in geringer Menge exprimiert. Zudem waren GD und GD-1 weitgehend unlöslich. Auch Anreicherungsversuche über Affinitätschromatographie erbrachten keine wesentliche Steigerung der Ausbeute. Für weiterführende Versuche mussten die gD-Fusionproteine in Form von 7 M Harnstoffextrakten eingesetzt werden. Western-Blot-Analysen mit den gD-Fusionsproteinen und PRV-spezifischen Seren erbrachten den Hinweis auf B-Zellepitope vor allem auf dem C-terminalen gD-Anteil (gD AS 170-402). Synthetische, um jeweils 10 AS überlappende Pentadecapeptide, die das gesamte gD repräsentieren (gD1-79), wurden hergestellt und über MS analysiert. Zur Kartierung von B-Zellepitopen wurden Peptid-ELISAs mit PRV-spezifischem Ziegen- und Inzuchtschweinserum und den Peptiden gD1-79 durchgeführt. Hierbei fanden sich im C-terminalen gD-Bereich (gD AS 271-402) lineare B-Zellepitope. Zur näheren Lokalisierung von T-Zellepitopen wurden Proliferationstests mit den gD-Fusionsproteinen und PRV-spezifischen PBMC von Inzuchtschweinen durchgeführt. Hier ergab sich der Hinweis auf T-Zellepitope im N-terminalen gD-Anteil (gD AS 1-170). Die den N-terminalen gD-Bereich repräsentierenden Peptide gD1-35 (gD AS 1-185) wurden zur Kartierung von T-Zellepitopen beim Inzuchtschwein eingesetzt. Hiermit konnte das T-Zellepitop gD16 (gD AS 76-90) identifiziert werden. Die gD16-spezifische PBMC-Proliferation erwies sich als MHC Klasse II-restringiert. Eine Beteiligung des CD8 Corezeptors und des MHC Klasse I-Moleküls blieb offen. Über IL-2-Aktivierungstests konnte eine starke gD16- und β -PL-PRV-spezifische IL-2-Produktion innerhalb der PBMC-Population, die aktivierten T-Helferzellen zugeschrieben werden kann, bereits innerhalb von 24 h nachgewiesen werden. Im Hinblick auf eine zukünftige Impfstoffentwicklung wurden die gD-Peptide auch zur Kartierung von T-Zellepitopen zweier Auszuchtschweine mit polymorphem MHC eingesetzt. Hiermit konnten für das Tier 1 15 potentielle T-Zellepitope und für das Tier 2 14 potentielle T-Zellepitope identifiziert werden. Es zeigte sich ein starker individueller Unterschied in der peptidspezifischen Reaktion. Mit dem Peptid gD15 (gD AS 71-85), das für das Tier 2 ein T-Zellepitop darstellt, konnte im IL-2-Aktivierungstest und in der RT-PCR keine spezifische IL-2- Produktion nachgewiesen werden. Il-2-Produktion und somit eine Th-1-typische Reaktion zeigte sich jedoch mit β -PL-PRV bereits innerhalb von 24 h im IL-2-Aktivierungstest und in der PCR nach 48 h. Die Peptide des Glykoproteins gB: gB17 (gB AS 341-355) und gB39 (gB AS 451-465) konnten in Proliferationstests mit PRV-spezifischen PBMC des Inzuchtschweines als T-Zellepitope bestätigt werden. Die gB17- und gB39-spezifische PBMC-Antwort erwies sich als MHC II-restringiert, als eine klassische T-Helferreaktion. Eine IL-2-Produktion PRV-spezifischer PBMC konnte mit dem Peptid gB39 nachgewiesen werden. Bislang sind für das Inzuchtschwein die T-Zellepitope gB17, gB39, gC50, gC72 und gD16 bekannt. In Proliferationstest mit PBMC der beiden Auszuchtschweine zeigte sich keine spezifische Reaktion mit den Peptiden gB17 und gB39. Die Peptide gC50 und gC72 erwiesen sich als T-Zellepitope für das Tier 2 und das Peptid gD16 für das Tier 1. Möglicherweise könnten die in der vorliegenden Arbeit aufgefundenen T- und B-Zellepitope Bestandteile eines PRV-Impfstoffes auf Epitopbasis darstellen. Fernziel ist die Entwicklung eines idealen PRV-Impfstoffes, der eine „sterile Immunität, protektiven Schutz ohne Latenzentwicklung und Virusausscheidung, ermöglicht.

Pseudorabiesvirus (PRV) is the causative agent of Aujeszky’s disease of pigs, leading to high financial losses in agriculture. Available vaccines don’t fulfil conditions for an ideal vaccine. New vaccines are at the development stage. PRV-glycoproteins play an important role in generating protective immunity against PRV. Therefore T- and B- cell epitopes of pseudorabiesviral glycoproteins should be identified. The focus was on T- and B-cell epitope-mapping of glycoprotein gD. At first three gD-fusion proteins were prepared in the bacterial expression system pEV40: GD (gD AA 1-402), representing the whole glycoprotein gD, GD-1 (gD AA 1-170), the N-terminal-, and GD-2 (GD AA 170-402), the C-terminal- gD-part. These should be used to narrow down B- or T-cell epitopes in Western blot analyses with PRV-specific sera or in proliferation tests with PRV-immune PBMC. The bacterial expression system pEV 40 was only fit for limited service in expression of the gD-fusion proteins. All three fusion proteins were only expressed in small quantities and GD and GD-1 were largely insoluble. Even accumulation experiments with affinity chromatography brought no significant increase of yield. So gD-fusion proteins had to be used as 7 M urea-extracts in further experiments. Western blot analyses with gD-fusion proteins and PRV-specific sera showed B-cell epitopes mainly on the C-terminal gD-part (gD AA 170-402). Synthetic pentadecapeptides, overlapping 10 AA, representing the whole GD (gD 1-79), were prepared and analyzed with MS. To map B-cell epitopes, peptide ELISA with PRV-specific goat- and inbred pig- sera and peptides gD1-79 were carried out. Here linear B-cell epitopes were found in the C-terminal gD-part (gD AA 271-402). For closer localization of T-cell epitopes, proliferation tests with gD-fusion proteins and PRV-specific PBMC of inbred pigs were carried out. Here T-cell epitopes were found in the N-terminal gD-part (gD AA 1-170). Peptides gD1-35 (gD AS1- 185), representing the N-terminal gD-part, were used to map T-cell epitopes of the inbred pig. In this way, the T-cell epitope gD16 (gD AS 76-90) could be identified. gD16-specific PBMC-proliferation was MHC class II-restricted. The role of the CD8 coreceptor and MHC class I- molecule remained open. With IL-2 activation assays a high gD16- and -PL-PRV- specific IL-2-production within the PBMC population, due to activated T-helper cells, could already be demonstrated within 24 h. In view of future vaccine development, gD-peptides were used to map T-cell epitopes of outbred pigs with polymorphic MHC. In this way, for one animal 15 potential T-cell epitopes and for another animal 14 potential T-cell epitopes could be identified. There was a high individual difference within the peptide specific reaction. For peptide gD15 (gD AA 71-85), representing a T-cell epitope of animal 2, with IL-2 activation assays and RT-PCR no specific IL-2-production could be detected. IL-2-production, and therefore a Th-1-typical reaction, was shown for -PL-PRV, even within 24 h with IL-2 activation assay and with PCR after 48 h.