Identification of a putative SUT1 mRNA binding protein using yeast three-hybrid analysis

Abstract

Sucrose is the major nutrient product of the photosynthesis reactions; its correct distribution via the specialized cells of the phloem is essential to plant survival. The transport of sucrose within solanaceous plants is mediated in part by sucrose transport proteins (SUTs) localized to the plasma membrane of the phloem sieve elements (SEs). SUT1, which is essential for phloem loading of sucrose, shows the predicted localization to the enucleate SE; its mRNA, initially thought to be found exclusively in the closely associated companion cell (CC), is also found in the enucleate SE. The mechanism of arrival and purpose of this mRNA localization in solanaceous plants has become a matter of dispute. The present work deals with the application of an in vivo method for the discovery of mRNA binding proteins, and the identification of a putative LeSUT1 mRNA binding protein.

A high quality cDNA library encoding tomato leaf protein fusions was synthesized and cloned for use in the yeast three-hybrid method (SenGupta et al., 1996). Several RNA hybrid molecules were designed based on the sequence and secondary structure of LeSUT1 mRNA and used to screen the cDNA library for putative mRNA binding proteins. A single isolated cDNA clone was shown to interact with two structurally dissimilar RNA baits. Northern blot and RACE analysis suggest that the isolated cDNA is a fragment of a larger molecule; sequence analysis suggests the presence of a putative RNA binding domain. The isolated cDNA encodes a novel protein molecule that is able to specifically interact with LeSUT1 mRNA in vivo and may be involved in the localization of SUT1 mRNA.

While the localization of SUT1 protein was previously established (Kühn et al., 1997), the mechanism of this localization has yet to be identified. In order to examine this process, tobacco sections were exposed to the fungal toxin Brefeldin A (BFA), which inhibits anterograde vesicle transport of proteins. SUT1 protein localization was inhibited by BFA application to fresh sections in preliminary experiments. When fresh tobacco sections were incubated in water, or exposed to no treatment, SUT1 protein was predictably localized to the SE. When fresh sections were exposed to 50 mM BFA for 10 minutes, however, SUT1 protein was sequestered in the CC; was visibly increased upon exposure to 100 mM BFA. These initial results contribute to the formation of an emerging model of SUT1 localization in which protein and mRNA are localized in separate but related events. The highly determined secondary structure of LeSUT1 3'UTR as well as the existence of multiple polyadenylation states also serves to support the concept of a highly regulated complex system resulting in the localization of SUT1 to the plasma membrane of the enucleate SE.

Saccharose ist das Hauptprodukt der Photosynthese und die richtige Verteilung von Saccharose durch das Phloem ist lebenswichtig für alle Pflanzen. Der Saccharosetransport in Solanaceen wird zum Teil durch Saccharosetransporter (SUT) vermittelt, die in der Plasmamembran der Siebelemente (SE) lokalisiert sind. SUT1, welches wesentlich zur Phloembeladung mit Saccharose beiträgt, ist wie erwartet in den zellkernlosen Siebelementen lokalisiert. Die SUT1 mRNA, die ursprünglich ausschließlich in den danebenliegenden Geleitzellen (CC) vermutet wurde, wird ebenfalls im zellkernlosen SE gefunden. Die Frage, wie SUT1 mRNA dorthin gelangt, sowie der Zweck dieser Lokalisierung in SE der Solanaceen ist noch ungeklärt. Die vorliegende Arbeit befasst sich mit der Anwendung einer in vivo Methode zur Suche nach mRNA-bindenden Proteinen sowie mit der Identifizierung eines möglichen LeSUT1 mRNA-bindenden Proteins.

Eine qualitativ hochwertige cDNA Bibliothek aus Tomatenblättern zur Anwendung in die 'Yeast three-hybrid' Methode wurde hergestellt. Basierend auf der Sequenz und der Sekundärstruktur von LeSUT1 mRNA wurden mehrere RNA Hybridmoleküle entworfen und als 'bait' zum 'screening' der cDNA Bibliothek nach möglichen mRNA-bindenden Proteinen verwendet. Ein einziger cDNA Klon interagierte mit zwei in ihrer Struktur unterschiedlichen RNA Hybridmolekülen. Northern Blot und RACE Experimente lassen vermuten, dass die isolierte cDNA ein Fragment eines größeren Moleküls darstellt. Die Sequenzanalyse dieses Fragments zeigt eine mögliche RNA-bindende Domäne. Die isolierte cDNA codiert für ein unbekanntes Protein, welches eine spezifische Interaktion mit der LeSUT1 mRNA zeigt und möglicherweise an der Lokalisierung der SUT1 mRNA beteiligt ist.

Obwohl die Lokalisation von SUT1 Protein bereits gezeigt wurde (Kühn et al. 1997), ist der Lokalisierungsmechanismus noch nicht geklärt. Um diesen Mechanismus zu untersuchen wurden frische Tabakschnitte mit dem Toxin Brefeldin A (BFA) behandelt, welches den Vesikeltransport von Proteinen hemmt. In vorausgehenden Experimenten inhibierte die BFA-Behandlung die Lokalisierung von SUT1 Protein. Die Inkubation von Tabakschnitten in Wasser sowie gar keine Behandlung der Schnitte führte zur Lokalisierung von SUT1 Protein in SE. Im Gegensatz dazu führte die Behandlung der Tabakschnitte mit BFA (50 mM BFA, 10 min) zur Akkumulation von SUT1 Protein in den Geleitzellen. Dieser Effekt wurde deutlich verstärkt durch die Behandlung mit 100 mM BFA. Diese ersten Ergebnisse tragen zur Erstellung eines sich entwickelnden Modells der SUT1 Lokalisierung bei, in welchem Protein und mRNA in getrennten aber in Beziehung zueinander stehenden Ereignissen lokalisiert werden. Sowohl die klar vorausgesagt Sekundärstruktur von LeSUT1 3'UTR als auch das Vorkommen von mehrfachen Polyadenylationstypen unterstützen ebenfalls die Vorstellung eines hochregulierten komplexen Systems, welches in der Lokalisierung von SUT1 an der Plasmamembran des zellkernlosen SE resultiert.