Untersuchung der Mikroautophagocytose in Saccharomyces cerevisiae

Abstract

Einen der wichtigsten Mechanismen zur Anpassung an widrige Bedingungen für eukaryotische Zellen stellt die Autophagocytose dar. Sie bietet den Zellen die Möglichkeit, durch gezieltes Recycling cytosolischen Materials die Zelle auf eine Überdauerung des Nahrungsmangels vorzubereiten. Bei der Mikroautophagocytose handelt es sich um einen Aspekt der Autophagocytose, der bislang im Modellorganismus Saccharomyces cerevisiae durch bildgebende Verfahren und durch Etablierung eines in vitro Nachweises beschrieben wurde. Es konnte noch nicht gezeigt werden, welche Zellkomponenten direkt an der Einstülpung der Vakuolenmembran beteiligt sind und wie die Abschnürung von Vesikeln ins Innere eines Organells hinein erfolgen kann. In dieser Arbeit wurde durch Expression des Phosphatidylinositol-3-Phosphat bindenden Proteins FYVE2 der erste Nachweis für eine direkte Einstülpung der Vakuolenmembran und für den Abbau dieses Membranabschnitts im Vakuolenlumen erbracht. Durch Einsatz von Makroautophagocytose-Mutanten in diesem Assay konnte gezeigt werden, dass Mikro- und Makroautophagocytose mechanistisch unterscheidbar sind, dass aber das Ausmaß des mikroautophagischen Membranabbaus abhängig ist vom makroautophagischen Membrantransport zur Vakuole. Die für die Mikroautophagocytose nötige Maschinerie ist unabhängig von Komponenten der Sortierung am „Multivesicular Body“. Es konnte nachgewiesen werden, dass das Lipid Phosphatidylinositol-3-Phosphat in vitro notwendig für den mikroautophagischen Membranabbau ist und dass es in vivo in Autophagischen Schläuchen angereichert wird. Durch Expression von eGFP-FYVE2 konnte indirekt eine laterale Sortierung des Lipids in der Vakuolenmembran und der Transport des Lipids unter Stickstoffmangelbedingungen in das Vakuolenlumen gezeigt werden. Es wurde die Hypothese aufgestellt, dass es sich bei der Mikroautophagocytose in S.cerevisiae um einen rein Lipid-vermittelten Prozess handelt. An der Mikroautophagocytose beteiligte Proteine konnten durch Einsatz von Hefedeletionsmutanten nicht identifiziert werden. Durch Experimente mit niedermolekularen Inhibitoren konnten Hinweise auf die Beteiligung bestimmter Proteine an der Bildung Autophagischer Schläuche und beim Abbau der abgeschnürten Vesikel gewonnen werden. Nach Sattler and Mayer (2000), Kunz et al. (2002) und aus den Ergebnissen dieser Arbeit wurde folgendes Modell für die Mikroautophagocytose in S.cerevisiae entworfen: durch Stickstoffmangel wird eine laterale Sortierung der Membranlipide und die Einstülpung der Hefevakuole induziert. Diese Strukturänderung erfolgt in Abhängigkeit von Stickstoffmangelbedingungen und kann durch GTP-gamma-S inhibiert werden. Das Lipid Phosphatidylinositol-3-Phosphat ist essentiell für die Abschnürung von Vesikeln ins Vakuolenlumen. Durch Beeinflussung der Lipidkonzentration oder des Protonengradienten der Vakuolenmembran wird diese Abschnürung verhindert. Vakuoläre Lipasen und Proteasen bauen die Vesikel im Lumen ab und stellen die Abbauprodukte für eine Wiederverwertung zur Verfügung.

Kunz, J. B., H. Schwarz, et al. (2003). "Determination of four sequential stages during microautophagy in vitro." J Biol Chem(2003 Dec 15 [Epub ahead of print]). Sattler, T. and A. Mayer (2000). "Cell-free reconstitution of microautophagic vacuole invagination and vesicle formation." Journal of Cell Biology 151(3): 529-38.

Autophagy is one of the most important mechanisms for eucaryotic cells to adjust to adverse environmental conditions. Directed recycling of cytosolic material allows cells the preparation for survival of starvation. Microautophagy is a sub-mechanism of autophagy, which has been described in the model organism Saccharomyces cerevisiae by means of microscopic approaches and by establishment of an in vitro assay. Specific cell components involved or the mechanism of invagination of a vesicle into the lumen of an organelle have not yet been found. This thesis furnishes the first proof for a direct invagination of the vacuolar membrane and degradation of this membrane section by expression of the phosphatidylinositol-3-phosphate-binding protein FYVE in yeast. Using macroautophagy-mutants in this assay showed, that macro- and microautophagy are mechanistically distinguishable, whereas the amount of microautophagic activity depends on macroautophagic membrane transport to the vacuole. The machinery for microautophagy is independent of sorting at the multivesicular body. The lipid phosphatidylinositol-3-phosphate is in vitro necessary for microautophagic membrane degradation and gets enriched in autophagic tubes in vivo. Expression of eGFP-FYVE2 showed an indirect lateral sorting of the lipid inside the vacuolar membrane and transport of the lipid during nitrogen starvation into the vacuolar lumen. The hypothesis was alleged that microautophagy in S.cerevisiae is a lipid-driven process. Using deletion mutants no microautophagic proteins could be identified. Experiments with low molecular weight inhibitors pointed to the involvement of certain proteins in the formation of autophagic tubes and in the scission of vesicles. According to Sattler and Mayer (2000), Kunz et al. (2003) and results from this work the following modell for microautophagy in S.cerevisiae was established: nitrogen starvation induces a lateral sorting of membrane lipids leading to invagination of the yeast vacuole, this structural change is inhibited by GTP-gamma-S. The lipid phosphatidylinositol-3-phosphate is essential for the scission of vesicles into the vacuolar lumen. Reducing the lipid concentration or the proton gradient can prevent scission. Vacuolar lipases and proteases degrade the vesicles inside the vacuolar lumen, providing the degradation products for re-use in the cytosol.

Kunz, J. B., H. Schwarz, et al. (2003). "Determination of four sequential stages during microautophagy in vitro." J Biol Chem(2003 Dec 15 [Epub ahead of print]). Sattler, T. and A. Mayer (2000). "Cell-free reconstitution of microautophagic vacuole invagination and vesicle formation." Journal of Cell Biology 151(3): 529-38.