Mycobacterial adenylyl cyclases Rv1625c and Rv0386: orthodox vs. unorthodox catalysis

Abstract

I report on two class III ACs of Mycobacterium tuberculosis which possess very different structural as well as catalytic characteristics: the mammalian-like membrane-anchored Rv1625c and the transcription-factor-attached Rv0386. As a complementary study to published data (Guo et al., 2001), additional point mutations were made which demonstrated the essential role of the six canonical amino acids for catalysis in Rv1625c. The cytosolic mutants of Rv1625c N372A, N372T and D300S were used to investigate dimerization with mammalian AC catalytic units. Rv1625c engineered to contain forskolin binding amino acids cannot be stimulated by the diterpene. The similarities in conformation and mechanisms of catalysis between ACs and GCs was confirmed through the formation of functional chimeras between Mycobacterium Rv1625c and a guanylyl cyclase of Paramecium. The versatility of the class III cyclase homology domains concerning their modular architectures and mechanisms of catalysis was demonstrated with the biochemical characterization of Rv0386. This enzyme has a substrate-defining mechanism distinctly different of that of mammalian ACs. In addition by using ATP as well as GTP as a substrate it is a unique AC isoform unknown so far. Mutational studies of the Rv0386 AC domain proved the essential role that is played by a glutamine and an asparagine instead of the canonical lysine and aspartate for recognition of ATP and GTP as substrates. Diffraction-quality crystals of this AC domain were obtained as a first step to decipher the molecular and structural particularities of its catalytic function. Sequence comparisons identified an ATPase, a HTH DNA-binding and a transcription factor domain in Rv0386. How these domains affect AC activity in a concerted regulatory mechanism remains a pressing question for future studies.

Im Rahmen der vorliegenden Arbeit wurden zwei Klasse III ACn aus Mycobacterium tuberculosis mit unterschiedlicher strukturellen und katalytischen Eigenschaften untersucht: die Mammalia-ähnliche Rv1625c und die an einen Transkriptionsfaktor gebundene Rv0386. Als ergänzende Studien zu bereits publizierten Daten (Guo et al., 2001), wurden zur Überprüfung der wesentlichen Rolle der sechs kanonischen Aminosäuren, die bei Mammalia-ACn in der Katalyse beteiligt sind und die in Rv1625c konserviert und auch katalytisch relevant sind, zusätzliche Punktmutationen durchgeführt und getestet. Die Rv1625c Mutanten N372A, N372T und D300S, die einzeln inaktiv sind, wurden für Rekonstitutionsversuchen benutzt wobei die Bildung katalytisch aktiver Homodimere in Rv1625c nachgewiesen wurde. Punktmutationen in Rv1625c, die Forskolin-bindende Aminosäuren in Säugercyclasen betreffen, erfahren dennoch keine Stimulierbarkeit durch das Diterpen. Die Ähnlichkeiten in Struktur und katalytischem Mechanismus zwischen ACn und GCn wurden hier bestätigt, da Chimären zwischen Mycobacterium Rv1625c und einer Guanylatcyclase aus Paramecium aktive katalytische Zentren gebildet haben. Die Vielseitigkeit der Klasse-III Cyclase Homologie Domänen hinsichtlich ihres modularen Aufbaus und ihres katalytischen Mechanismus wurde hier durch die biochemische Charakterisierung von Rv0386 nachgewiesen. Dieses Enzym zeigte einen Mechanismus zur Erkennung des Substrates, der sich von dem der Mammalia-ACn deutlich unterscheidet. Dieser ermöglicht die Erkennung sowohl von ATP als auch GTP als Substrat und ist eine Eigenschaft, die bis jetzt in keiner anderen AC Isoform beobachtet wurde. Mutationen der AC Domäne beweisen die essentielle Rolle, die Glutamin und Asparagine statt dem kanonischen Lysin und Aspartat bei der Erkennung der Substrate ATP und GTP in Rv0386 spielen. Der Erhalt der ersten diffraktionsfähigen Kristalle der AC Domäne innerhalb dieser Arbeit ist ein erster Schritt zur Erkenntnis der Besonderheiten ihrer katalytischen Funktion. Die Suche nach Sequenz Ähnlichkeiten zeigte, dass Rv0386 zusätzlich zu der AC Domäne aus ATPase-, HTH DNA-bindungs- und Transkriptionsfaktor-Domänen besteht. Noch zu beantworten bleibt die Frage, wie die regulatorische Verbindung zwischen der AC Domäne und dem Transkriptionsregulator AC Aktivität und weitere unbekannte Regulationsmechanismen beeinflusst.