Klonierung und Charakterisierung von fünf Adenylatcyclasen aus Stigmatella aurantiaca und Mycobakterium tuberculosis

Abstract

In dieser Arbeit wurden fünf Adenylatcyclasen (ACn), cyaB aus Stigmatella aurantiaca sowie Rv1318c, Rv1319c, Rv1320c und Rv3645 aus Mycobakterium tuberculosis (H37Rv) untersucht. Sie sind durch einen Aminosäureaustausch im katalytischen Zentrum von Aspartat (D) nach Threonin (T) gekennzeichnet, der sie gleichzeitig in die AC-Klasse IIIb einordnet. Das katalytische Zentrum von cyaB wurde charakterisiert, um als mögliches Modell für Wechselwirkungen mit fremden Domänen zu dienen. Die Konstrukte von cyaB mit den fremden Domänen waren unlöslich und durch eine Reinigung nicht zugänglich. Im Genom von Mycobakterium tuberculosis (H37Rv) wurden 15 mutmaßliche ACn identifiziert. Vier von ihnen (s.o.) zeichnen sich durch den gleichen Domänenaufbau aus: Auf einen cytosolischen N-terminus folgen 6 Transmembranspannen (TM), eine HAMP-Domäne (gefunden in Histidinkinasen, Adenylatcyclasen, Methyl-akzeptierenden chemotaktischen Proteinen und Phosphatasen) und die AC Domäne. Die HAMP-Domäne geht ohne erkennbaren Übergang aus der 6. TM hervor und besteht aus zwei amphipathischen alpha-Helices (je 18 Aminosäuren), die durch einen Linker von 14 Aminosäuren verbunden sind. Das gereinigte rekombinante katalytische Zentrum von Rv1319c war als einziges der mycobakteriellen ACn robust aktiv, während die rekombinante AC Rv3645 das einzige aktive Holoenzym darstellte. Diese unterschiedlichen Aktivitäten konnten auf den Einfluß der HAMP-Domäne zurückgeführt werden: die Aktivität von Rv1319c wurde durch die HAMP-Domäne gehemmt, während die Aktivität von Rv3645 aktiviert wurde. Aminosäureaustausche in der HAMP-Domäne unterstrichen die Bedeutung der sterischen Anordnung der amphiphatischen Helices.

This dissertation details the investigation of five prokaryotic adenylyl cyclase (AC) proteins: CyaB of Stigmatella auarantiaca (TP610) and Rv1318c, Rv1319c, Rv1320c and Rv3645 of Mycobacterium tuberculosis (H37Rv). The ACs are characterised by an aspartate (D) to tyrosine (T) polymorphism in the catalytic centre, classifying them as Class IIIb ACs. The catalytic centre of CyaB was characterised as a potential model system for foreign domain interactions, but recombinant CyaB-foreign domain constructs were insoluble and could not be isolated. 15 putative AC encoding open reading frames have been identified in the genome of Mycobacterium tuberculosis (H37Rv). Four of them (see above) have a similar domain composition consisting of a cytosolic N-terminus, 6 transmembrane (TM) spans, a HAMP-domain (found in Histidinkinases, Adenylyl cyclases, Methyl-accepting proteins and Phosphatases), and an AC domain. The HAMP-domain emerges without discernible transition from the sixth TM pass and consists of two amphipathic alpha-helices (18 aa each) connected by a 14 amino acid linker. The purified recombinant catalytic centre of Rv1319c was the only experimentally identified robust active AC whereas recombinant Rv3645 was the only identified active holoenzyme. These differing activities were attributed to the influence of the HAMP-domain: the HAMP-domain of Rv1319c was inhibitory for the AC domain while that of Rv3645 activated the AC domain. Amino acid exchanges within the HAMP-domain of Rv1319c and Rv3645 underlined the importance of sterical order between the amphipathic helices.