Parallele, markierungsfreie Detektion biomolekularer Wechselwirkungen an Mikroarrays

Abstract

Das Ziel der vorliegenden Arbeit war es, die Informationstiefe eines Biosensor-Experiments bezüglich der genauen Charakterisierung einer biomolekularen Wechselwirkung mit einer hohen Parallelität zu verbinden. Im Hinblick auf die Ziele des BMBF-Verbundprojektes Gensensorik stand die Entwicklung von Mikroarrays zur Wechselwirkungsanalytik mittels eines Biosensors im Mittelpunkt. Zur Erreichung des Ziels in dieser Arbeit war die Reflektometrische Interferenzspektroskopie (RIfS) der Ausgangspunkt. Diese direkt optische Biosensortechnologie eignet sich für eine Parallelisierung durch seine spezifischen Eigenschaften besonders. Weiterhin konnte dies bereits in einem anderen BMBF-Verbund (Librarian II) auf einem Mikrotiterplatten-Aufbau gezeigt werden. In dieser Arbeit sollten nun einerseits verschiedene Teilaspekte der Minaturisierung und Parallelisierung von optischen Biosensorexperimenten anhand von RIfS untersucht und andererseits musste die Biosensortechnologie selbst einen Schritt in Richtung Detektion auf Mikroarrays vorangebracht werden. Im einzelnen fielen dabei die folgenden Teilaufgaben an: - Ein Laboraufbau eines Gerätes zur parallelen markierungsfreien Detektion wurde auf die Anforderungen eines Mikroarray Experiments umgerüstet. Dabei waren die Charakterisierung des optischen Aufbaus und das experimentelle Evaluieren der Limitierungen dieses Aufbaus erforderlich. - Außerdem wurde die Oberflächenchemie in Kombination mit einer Methode zur ortsaufgelösten Immobilisierung für die Tauglichkeit für Mikroarrays weiterentwickelt und getestet. Hier standen vor allem die Charakterisierung und Optimierung der Oberflächenchemie hinsichtlich ihrer Langzeitstabilität und Bindungskapazität im Vordergrund. Auch die Auswahl geeigneter Sonden und der Vergleich mit DNA-Sonden wurde bearbeitet. - Die bisherigen Kapazitäten der Reflektometrischen Interferenzspektroskopie für die Analyse von Hybridisierungsvorgängen an Oberflächen wurden erweitert, um den höheren Anforderungen von zeitaufgelösten und temperaturabhängigen Hybridisierungsmessungen zu genügen. Beispielhaft wurden dazu in dieser Arbeit Verfahren überprüft, um Affinität und Kinetik von Bindungsvorgängen auch in homogener Phase zu bestimmen. Eingesetzt wurden dafür als Modellsysteme Oligonukleotide, die eine Rolle in der Antisense-Forschung spielen und dazu bestimmten Modifikationen unterworfen wurden. - Die Machbarkeit von Hybridisierungsexperimenten auf einem parallelen RIfS-Aufbau und Erkennung der erforderlichen Maßnahmen zur Miniaturisierung des Probenträgers wurde schrittweise durch Vergleichsmessungen an bereits existierenden Aufbauten gezeigt. Der RIfS-Mikroarray-Aufbau wurde durch Vergleichsmessungen mit Antikörpern charakterisiert. Damit wurde gleichzeitig auch eine Eignung der Methode für weiterführende Anwendungen, wie Proteinarrays, demonstriert. - Schließlich wurden Hybridisierungsvorgänge auf einem DNA-Mikroarray auf dem umgebauten und charakterisierten RIfS-Aufbau zeitaufgelöst detektiert, und damit die Tauglichkeit dieses Aufbaus für den Einsatz in einem Gensensor Experiment nachgewiesen. Zusammenfassend wurde in dieser Arbeit untersucht, ob die Reflektometrische Interferenzspektroskopie den Anforderungen genügt, die an ein Gensensorsystem gestellt werden. Hierzu wurden sowohl Einkanal Messungen zur Affinitätsbestimmung durchgeführt, als auch verschiedene parallele Detektionssysteme zur Charakterisierung von Hybridisierungen an Oberflächen verwendet. Die Oberflächenchemie wurde in einem weiten Bereich optimiert und auf die Problemstellung angepasst. Schließlich wurden technische Änderungen an RIfS-Systemen entwickelt, die erstens temperaturabhängige Messungen ermöglichen und zweitens, die markierungsfreien Messungen von Hybridisierungsvorgängen auf Mikroarrays ermöglichen. Zusammenfassend erweist sich die RIfS als optische Detektionsmethode diesen Anforderungen als gewachsen. Die Ziele dieser Arbeit konnten somit erreicht werden.

The main objective of the presented work was, to improve the information content of a biosensor experiment. Investigations were made concerning its ability to characterize a biomolecular interaction and in terms of parallelization of the experiment. Within the collaborative project “gene-sensor” the development of microarrays with biosensor-detection abilities was the main focus of this work. To achieve those goals, Reflectometric Interference Spectroscopy (RIfS) was used as a detection method. This direct optical biosensor-method is well suited for parallelization because of its particular features. This could already be proven for a RifS-microplate set-up within another project, called Librarian II. On the one hand, in this thesis the partial aspects of miniaturization and on the other hand the biosensor-technology itself were developed towards detection on a microarray. In particular, the following tasks had to be worked on: - A lab-prototype of an instrument for label-free and parallel detection was rebuilt to fit the needs of a microarray-experiment. Here the characterization of the optical set-up as well as the experimental evaluation of the limitations was essential. - Furthermore the surface chemistry in combination with a spatially resolved method for immobilization was further developed to be used on a RIfS-Microarray. Long-term stability and binding capacity of the surface were the main focus of this part. - The previous capabilities of RIfS were extended to fit the needs of temperature-dependent and time-resolved measurements of hybridization. As an example, antisense-oligonucleotides were characterized kinetically, even in homogenous phase, by the use of RIfS. - The feasibility of microarray experiments on the parallel RIfS set-up were shown step by step on already existing prototypes. The RIfS-Microarray set-up was first characterized with antibody-measurements showing at the same time its suitability for measurements on protein-arrays. - Finally hybridization was detected time-resolved on the characterized RIfS-set-up, which proved the feasibility of gene-sensor-experiments on the system. To summarize, in this thesis, the feasibility to do gene-sensor measurements with the RIfS-system was shown. Single channel measurements as well as various parallel measurement-systems were used to characterize hybridization on RIfS-surfaces. The surface chemistry was optimized in a wide range and adapted to the problem. Finally technical variations of the RIfS-system were developed, which firstly allow temperature-dependent measurements and secondly enable hybridization measurements on microarrays. The RIfS-method can cope with those challenges thus the goals of this thesis could be achieved.