Identifizierung und Charakterisierung eines neuen Ligand-Rezeptor-Systems der retinotectalen Projektion

Abstract

Das parallele Wachstum einer Vielzahl von Geweben und Organen während der Embryonalentwicklung stellt eine große Herausforderung an eine exakte Ordnung und Koordination der stattfindenden Vorgänge dar. Neben zahlreichen anderen Systemen, die für den Körper unabdingbar sind, ist die korrekte Verschaltung des Nervensystems dabei essentiell. Diese Verschaltung von Ursprungs- und Zielgebiet durch die Axone erfolgt mittels vorgegebener Pläne, den sogenannten topographischen Karten. Für die Ausbildung dieser Karten bedient sich der Körper der Lenkungsmoleküle, Signalen die dafür sorgen, dass die Nervenfasern den richtigen Weg finden und im Zielgebiet auch zur jeweiligen Zielzelle geführt werden. Um ein Verständnis für die molekularen Mechanismen bei der Ausbildung der Karten mit Hilfe der Lenkungsmoleküle zu bekommen, wurde die retinotectale Projektion des Hühnerembryos als Modellsystem untersucht. In den letzten Jahren wurden zahlreiche Moleküle und Mechanismen, die auch in anderen Systemen Gültigkeit besitzen, anhand dieser Projektion entdeckt. Dennoch war und ist das Gesamtbild noch unvollständig. Die im Rahmen dieser Arbeit gewonnen Erkenntnisse tragen sehr viel zur Ergänzung des Gesamtbildes und zur Aufklärung der molekularen Mechanismen der Axonlenkung bei. Die Identifizierung und Charakterisierung eines neuen Ligand-Rezeptor-Systems der retinotectalen Projektion stand dabei im Mittelpunkt der Arbeit. So wurde erstens ein wesentlicher Beitrag zu genaueren Charakterisierung von RGM (dem 1990 biochemisch isolierten (Stahl et al.) und 1999 von PD Dr. B. K. Müller und Kollegen klonierten repulsive guidance molecule) geleistet. Nicht nur die Untersuchung der zeitlichen Expressionsmuster sowohl im retinotectalen System wie auch der entorhinalen Projektion im Hippocampus bestätigten eine mögliche Beteiligung von RGM bei der Ausbildung beider topographischer Karten während der Embryonalentwicklung. Auch die Expressionsmuster im Gewebe des Hühnerembryos zusammen mit den in vitro Daten konnten sowohl bezüglich der RNA- wie auch der Expression auf Proteinebene eine Beteiligung von RGM an der Ausbildung der retinotectalen Projektion bestätigen. Die Ergebnisse dieses Teils der Arbeit sind in die Publikation Monnier et al., 2002 eingeflossen. Weiterhin wurden geeignete Werkzeuge für die Isolierung von RGM-bindenden Proteinen in Form von RGM-AP-Fusionsproteinen entwickelt, die anschließend hergestellt, charakterisiert und erfolgreich eingesetzt wurden. Auch die Charakterisierung des RGM-AP führte zur Klärung eines wichtigen Teilaspekts bei der Charakterisierung des RGM. So konnte mit Hilfe dieses Konstrukts und seiner identischen Eigenschaften mit dem nativen RGM eine posttranslationale Spaltung gezeigt werden. Zudem wurde mit Hilfe des Fusionsproteins nicht nur ein Bindungspartner für RGM gefunden, sondern auch die weitere Charakterisierung der Bindungsspezifität durchgeführt. Schließlich gelang in einer Kooperation mit Prof. Dr. S. M. Strittmatter die Isolierung eines RGM-bindenden Moleküls, von welchem aufgrund der in dieser Arbeit beschriebenen wissenschaftlichen Ergebnisse und der sich daraus ableitenden Spezifität, Aktivität und seiner Charakteristika mit höchster Wahrscheinlichkeit angenommen werden kann, dass es als RGM Rezeptor fungiert. Aufgrund der in der vorliegenden Arbeit erhaltenen Ergebnisse konnte ein neues Ligand-Rezeptor-System neben der Ephrin-Eph-Rezeptorfamilie als neue Familie von Axonlenkungsmolekülen, die wahrscheinlich maßgeblich an der Ausbildung des retinotectalen Systems im Huhn beteiligt ist, auf molekularer Ebene charakterisiert werden. Dies bildet die Grundlage für weitreichende und über die Entwicklungsbiologie hinausgehende Forschungsaktivitäten, da neueste Ergebnisse darauf hinweisen, dass RGM zum einen an der Entwicklung anderer topographischer Karten und in anderen Spezies beteiligt ist, sowie zum anderen aber auch im adulten Tier nach Läsionen des ZNS erneut exprimiert wird und vermutlich als ein die Regeneration inhibierendes Molekül aktiv ist.

Development and growth of many tissues and organs takes place in parallel during the embryonal development. Therefore a very high number of processes in the body have to be organized and coordinated. Besides numerous other systems, which are indispensable for the body, the nervous system and its proper connection is essential for proper functioning of an organism. The connections from origin and target region via the axons of nerve cells form so-called topographic maps. The implementation of these maps is due to guidance molecules, which insure, that axons find their appropriate way and are guided to the matching target cell. The retinotectal projection of the chick embryo serves as one model system to investigate the underlying molecular mechanisms of map formation and axon guidance. In recent years numerous molecules and mechanisms, which were found to be important for the development of the retinotectal projection, have also been found in other systems. Nonetheless, many questions remain to be answered. The results obtained in the experimental part of this thesis, give answers to open questions and help to better understand the molecular mechanisms of axon guidance. Thereby the focus of this work was the identification and characterization of a novel ligand receptor system, that is involved in the formation of the retinotectal projection. First a of all, essential discoveries were provided for the characterization of RGM (the repulsive guidance molecule, which was isolated biochemically 1990 (Stahl et al.) and cloned by PD Dr. B. K. Mueller an colleagues 1999). Not only that examination of the temporal expression pattern in the retinotectal system as well as the enthorinal projection confirmed a potential participation of RGM during the development of both topographic maps but in addition, also the expression patterns, on RNA- and protein level, in the chick embryo tissue suggested, together with data from in vitro experiments, that RGM is a major player in the retinotectal projection development. The results of the first part of this thesis were integrated into the publication Monnier et al. 2002. Furthermore, tools suitable to isolate RGM binding molecules, in the form of RGM-AP fusion proteins, were developed, which were then produced, characterized and, successfully applied in experiments. Additionally, the characterization of the RGM-AP fusion protein proofed to be an important step in the finer molecular analysis of RGM. Due to this construct, that shares identical properties with native RGM, the posttranslational processing by proteolytic cleavage could be shown. Farther using the fusion protein, not only a binding partner for RGM was found, but also further characterization of the binding specificity was determined. Finally the isolation of a RGM-binding molecule was successfully carried out in cooperation with Prof. Dr. S. M. Strittmatter from Yale University. Concerning the scientific discoveries, which are described in this thesis and the resulting specificity, activity and its characteristics is most likely that this isolated molecule functions as RGM receptor. Summarizing the results from this thesis, a novel ligand receptor system, besides the well known Ephrin Eph-receptor family, could be characterized on the molecular level, and seems to be a major component during the development of the retinotectal system in the chick embryo. Therefore the basis for further investigations was set, which goes even beyond developmental biology. Recent results show, that RGM is active in the formation of other topographic maps in other species and it was also shown that in adult animals after lesioning the CNS, RGM is up regulated. Therefore it is very likely that RGM functions as well as a regeneration inhibitor.