Identifizierung und Charakterisierung differentiell exprimierter Gene in Hämocyten Schistosoma mansoni-resistenter und -suszeptibler Zwischenwirtschnecken Biomphalaria glabrata

Abstract

Süßwasserschnecken der Gattung Biomphalaria dienen Schistosoma mansoni zur Aufrechterhaltung ihres Lebenszyklus als Zwischenwirt. Die Effizienz des Immunsystems der Schnecken spielt eine Schlüsselrolle im Überleben bzw. im Abtöten der Parasiten. Dringen Schistosomenlarven in resistente Schnecken ein, werden diese von den Abwehrzellen des Zwischenwirtes, den Hämocyten, eingekapselt und innerhalb von 48 Stunden zerstört. Im Gegensatz dazu findet in suszeptiblen Schnecken keine Abwehrreaktion gegenüber dem Parasiten statt. Es scheint, dass Schistosomen das Potenzial besitzen, das Abwehrsystem dieser Zwischenwirte zu modulieren und es zu beeinflussen. Ziel der vorliegenden Arbeit ist es, Unterschiede in der Genexpression sowohl in Hämocyten von Schistosomen-suszeptiblen und -resistenten Biomphalarien, als auch in Abwehrzellen von infizierten und nichtinfizierten Schnecken aufzuzeigen. Mit Hilfe der Methoden der Differential Display RT-PCR und des Single Strand Conformation Polymophismus (SSCP) konnten insgesamt 112 differentiell exprimierte DNA-Transkripte detektiert und analysiert werden. Die meisten der untersuchten Fragmente (85%) zeigten keine Homologien zu bekannten Sequenzen und wurden deshalb als neue Genabschnitte in die Datenbank eingegeben. 14 der analysierten DNA-Transkripte weisen Homologien zu Genen bzw. Proteinen auf, denen unter anderem Funktionen bei der Signaltransduktion (Serin/Threonin Kinase), bei Abwehrreaktionen (Fibrinogen verwandte Proteine-FREPs, SNF7/VPS-Proteine, Ribosomales Protein L29), im Zellzyklus (Polo-like Kinase, Septin, Glutamin-Phosphoribosylpyrophosphat-Amidotransferase) oder beim Gene-silencing (Methyl-CpG-bindendes Protein) zukommen. Durch Parasiteninfektion induzierte Veränderungen in der Genexpression der Hämocyten konnten in beiden Schneckenphänotypen dokumentiert werden. Qualitative Unterschiede traten vor allem in resistenten Biomphalarien auf, während bei den suszeptiblen Schnecken überwiegend quantitative Veränderungen in der Genexpression festgestellt werden konnten. Ferner wurde beobachtet, dass während des Verlaufs einer Parasiteninfektion in den Hämocyten der resistenten Schnecken mehr Genabschnitte herunter- als hochreguliert werden. Im Gegensatz dazu werden in den Abwehrzellen der suszeptiblen Schnecken mehr Gene hoch- als herunterreguliert. Zur Abwehr von Parasiten werden in den Hämocyten Sauerstoffmetabolite (ROS) generiert, wobei dem Wasserstoffperoxid (H2O2) hinsichtlich des Killings eine entscheidende Rolle zufällt. Für den Auf- und Abbau von H2O2 sind die antioxidativen Enzyme Superoxid-Dismutase (SOD) und Catalase (CAT) verantwortlich. Mit Hilfe der OneStep RT-PCR konnte die Expression dieser Enzyme sowohl in den Hämocyten der resistenten als auch in denen der suszeptiblen Biomphalarien nachgewiesen werden. Während der Infektion mit Schistosoma mansoni zeigte sich, dass die SOD-Expression in den resistenten Biomphalarien zu einem früheren Zeitpunkt einsetzt als in den Hämocyten der empfänglichen Schnecken. H2O2 wird schneller produziert, wodurch die Abwehreaktion auch früher einsetzen kann. Bei der Untersuchung der Catalase-Expression konnte beobachtet werden, dass H2O2 in den Abwehrzellen der R-Schnecken im Verlauf der Infektion nur sehr langsam wieder degeneriert wird, während dies dagegen in den empfänglichen Biomphalarien von Anbeginn der Infektion in hohem Maße geschieht. Möglicherweise ist dadurch die H2O2-Konzentration stets zu gering, um eine erfolgreiche Abwehr gegenüber den Schistosomen auszuüben.

Freshwater snails of the genus Biomphalaria are essential intermediate hosts in the life cycle of Schistosoma mansoni, and the efficiency of their immune system plays the key role for parasite survival or elimination. On entry into resistant snails, host defence cells (hemocytes) encapsulate and destroy the invading schistosome larvae within 48 hours. In contrary, there is no marked cellular reaction against the parasite in susceptible snails. One major aspect to ensure survival within the snails is the parasite?s potential to modulate the defence capabilities of their intermediate hosts. The aim of this study is to detect differences in gene expression between hemocytes from schistosome-susceptible and -resistant phenotype and from naïve and infected snails. Altogether 112 differentially expressed gene fragments were detected and analysed by Differential Display RT-PCR and confirmed by using single strand conformation polymorphism (SSCP). Most of the identified sequences (85%) did not show any homologies to known sequences from GenBank database, thus, they represent novel genes. Fourteen of the analysed DNA-transcripts showed homologies in their sequence to genes coding for proteins of signalling pathways (serine/threonine kinase), in defence mechanisms (fibrinogen related proteins-FREPs, SNF7/VPS-proteins, ribosomal protein L29), in cytokinesis (polo-like kinase, septin, glutamine-phosphoribosylpyrophosphate-amidotransferase) or in gene-silencing (methyl-CpG-binding protein). Parasite-induced changes in hemocyte gene expression were detected in both, susceptible and resistant, hosts. Qualitative changes occurred predominantly in resistant snails. Changes in susceptible snails were rather quantitative than qualitative. Further investigation of gene expression showed predominantly more down-regulated genes in hemocytes of resistant snails and more up-regulation in susceptible snails during time course of infection. In hemocytes of Biomphalaria glabrata reactive oxygen species (ROS) are produced to defeat and destroy invaded parasites. The most important role in this killing mechanism plays hydrogen peroxide (H2O2) which is generated and degraded by the antioxidative enzymes superoxide dismutase (SOD) and catalase, respectively. Using OneStep RT-PCR expression of these enzymes was detected in hemocytes of both, resistant and susceptible, hosts. During infection with Schistosoma mansoni it was demonstrated that expression of SOD in resistant snails starts earlier than in hemocytes of susceptible hosts. H2O2 was produced significantly faster, thus, defence reaction could start earlier. Beside that it was shown that expression of catalase in hemocytes of resistant snails was very low in the first 6 hours during time course of infection, whereas degradation of hydrogen peroxide in susceptible snails took place in high degree from the early beginning of infection. Thus, it might will be that H2O2-level is possibly always too low to result in successful defence reaction towards schistosomes in susceptible snails.