Molekularbiologische und biochemische Untersuchungen zur Biosynthese der Aminocoumarinantibiotika Simocyclinon D8, Novobiocin, Clorobiocin und Coumermycin A1

Abstract

Aminocoumarin-Antibiotika werden von unterschiedlichen Streptomyces-Stämmen produziert und üben ihre therapeutische Aktivität durch Hemmung der bakteriellen DNA-Gyrase aus. In den USA wurde Novobiocin (AlbamycinÒ, Pharmacia & Upjohn) für die Behandlung von Infektionen mit Gram-positiven Bakterien am Menschen zugelassen. Durch die relativ hohe Toxizität in Eukaryonten, die schlechte Wasserlöslichkeit und die nur geringe Aktivität gegenüber Gram-negativen Bakterien blieb die klinische Anwendung dieses Antibiotikums auf spezielle Fälle beschränkt. Daher ist es von Interesse, neue strukturell modifizierte Aminocoumarin-Antibiotika zu produzieren und zu testen, ob diese die Einschränkungen der bekannten Substanzen überwinden können. Die erste Aufgabe des Projektes war es, das Biosynthesegencluster des ungewöhnlichen Aminocoumarin-Antibiotikums Simocyclinon D8 zu identifizieren. Dazu wurde eine Cosmidbank von Streptomyces antibioticus Tü 6040 mit einer heterologen Sonde von dem Gen novI, das ein Cytochrom P450-Enzym aus dem Novobiocin-Cluster codiert, gescreent und eines der hybridisierenden Cosmide sequenziert. Die Analyse eines 39,4 kb großen Sequenzbereiches erlaubte die Identifizierung von insgesamt 38 Open Reading Frames (ORFs), wovon 6 starke Sequenzhomologie zu Genen des Novobiocin- und Coumermycin A1-Biosynthesegenclusters aufwiesen. Die Struktur von Simocyclinon enthält auch ein Angucyclinon-Ringsystem, und 12 der identifizierten ORFs zeigten hohe Ähnlichkeit mit Biosynthesegenen anderer Angucyclinon-Antibiotika. Mögliche Funktionen innerhalb der Simocyclinon D8-Biosynthese konnten für 23 ORFs durch Vergleiche mit Sequenzen in der Datenbank GenBank postuliert werden. Der experimentelle Beweis für die Beteiligung eines dieser Gene an der Biosynthese der Aminocoumarin-Einheit wurde durch Inaktivierung dieses Genes erbracht. Untersuchungen der Sekundärstoffproduktion der resultierenden Mutante zeigten, dass diese die Fähigkeit zur Bildung des Aminocoumarin-Ringes vollständig verloren hatte. Eine anschließende Fütterung der Defektmutante mit einem strukturell verwandten Aminocoumarin-Ring führte zur Bildung eines neuen, mutasynthetisch erhaltenen Simocyclinon-Derivates. Im zweiten Teil ging es darum, durch Mutasynthese neue Aminocoumarin-Antibiotika herzustellen. Die chemischen Strukturen der Aminocoumarin-Antibiotika Novobiocin, Clorobiocin und Coumermycin A1 enthalten Amidbindungen, die eine aromatische Acylkomponente mit dem für diese Substanzgruppe charakteristischen 3-Amino-4,7-dihydroxycoumarin (ADHC)-Ring verbinden. Diese Amidbindungen werden unter Katalyse der Genprodukte von novL, cloL und couL geknüpft. Zunächst wurde die Substratspezifität der gereinigten Amidsynthetasen NovL, CloL und CouL bezüglich verschiedener synthetischer Analoga der 3-Dimethylallyl-4-hydroxybenzoesäure (DMAHB)-Einheit untersucht. CloL akzeptierte ein breites Spektrum synthetischer Ring A-Analoga, und daher wurde eine geeignete Mutante des Clorobiocin-Produzenten Streptomyces roseochromogenes für die anschließenden Mutasynthese-Experimente ausgewählt. Die Fütterung 13 verschiedener Substratanaloga an diese Mutante, die in der DMAHB-Biosynthese defekt ist, resultierte in der Bildung von 32 neuen Aminocoumarinen, die anschließend im präparativen Maßstab isoliert wurden. Die Strukturaufklärung dieser Substanzen erfolgte mit FAB-MS- und 1H-NMR-spektroskopischen Methoden. Die große Anzahl an neuen Strukturen, die durch diese Experimente gewonnen wurden, zeigt deutlich das hohe Potential der Mutasynthese für die Entwicklung neuer Aminocoumarin-Antibiotika. Diese neuen Clorobiocin-Derivate wurden bezüglich ihrer antimikrobiellen Aktivität gegenüber verschiedenen Gram-positiven und Gram-negativen Mikroorganismen sowie bezüglich ihrer gyrasehemmenden Aktivität untersucht. Die Testsubstanzen unterschieden sich in der mit dem ADHC-Ring verknüpften Benzoesäure-Komponente, der An- oder Abwesenheit des 5-Methyl-1H-pyrrol-2-carboxyl-Substituenten sowie der Verknüpfungsposition mit dem Deoxyzucker L-Noviose und der An- oder Abwesenheit eines Chlor-Atomes an C-8 der ADHC-Einheit. Clorobiocin war in diesen Versuchen am stärksten aktiv und übertraf auch Novobiocin. Einige Substanzen waren in ihrer Aktivität mit Novobiocin vergleichbar und könnten erfolgversprechende Kandidaten für die Arzneistoffentwicklung darstellen. Eine Positionsverschiebung der 5-Methyl-1H-pyrrol-2-carboxyl-Gruppe vom 3’’-O auf das 2’’-O der L-Noviose oder eine Entfernung des Chlor-Atoms von C-8 des ADHC-Ringes reduzierten die Bioaktivität der Substanzen um den Faktor zwei bis vier. Demgegenüber führte die Entfernung der Methylgruppe von 4’’-O der L-Noviose zum nahezu vollständigen Verlust der antibiotischen Aktivität. Diese Ergebnisse demonstrieren deutlich die wichtige Rolle der Substituenten von Clorobiocin und seinen Derivaten für die antimikrobielle Aktivität sowie für die Hemmwirkung gegenüber der E. coli DNA-Gyrase.

Aminocoumarin antibiotics are produced by different Streptomyces strains and exert their therapeutic activity through inhibition of bacterial DNA gyrases. In the USA novobiocin (AlbamycinÒ, Pharmacia & Upjohn) is licensed for the treatment of human infections with gram-positive bacteria. However, due to their toxicity in eukaryotes, their poor water solubility, and their low activity against gram-negative bacteria, clinical use of these antibiotics remains restricted. Therefore it is of interest to test whether new, structurally modified aminocoumarin antibiotics may be able to overcome the limitations of the known compounds. The first task of my thesis was to identifiy the biosynthetic gene cluster of the unusual aminocoumarin antibiotic simocyclinone D8. For this project a cosmid library of Streptomyces antibioticus Tü 6040 was screened with a heterologous probe from the gene novI encoding a cytochrome P450 enzyme from the novobiocin biosynthetic gene cluster and one of the hybridising cosmids was sequenced. Sequence analysis of a 39.4-kb region revealed the presence of 38 open reading frames (ORFs) and six of them showed striking similarity to genes from the biosynthetic gene clusters of novobiocin and coumermycin A1. Simocyclinone also contains an angucyclinone moiety, and 12 of the ORFs showed high sequence similarity to biosynthetic genes of other angucyclinone antibiotics. Possible functions within the biosynthesis of simocyclinone D8 could be assigned to 23 ORFs by comparison with sequences in GenBank. Experimental proof for the function of the identified gene cluster was provided by a gene inactivation experiment, which resulted in the abolishment of the formation of the aminocoumarin moiety of simocyclinone. Feeding of the mutant with the aminocoumarin moiety of novobiocin led to a new, artificial simocyclinone derivative. The second part of my thesis was to generate new aminocoumarin antibiotics by mutasynthesis experiments. The chemical structures of the aminocoumarin antibiotics novobiocin, clorobiocin and coumermycin A1 contain amide bonds, formed between an aromatic acyl component and the characteristic 3-amino-4,7-dihydroxycoumarin (ADHC) ring. These amide bonds are formed under catalysis of the gene products of novL, cloL and couL, respectively. First the substrate specificity of the purified amide synthetases NovL, CloL and CouL for various synthetic analogs of the 3-dimethylallyl-4-hydroxybenzoate (DMAHB) moiety was examined. CloL accepted the most suitable range of compounds, and therefore a mutant strain of the clorobiocin producer Streptomyces roseochromogenes was chosen for the mutasynthesis experiments. Feeding of 13 substrate analogs to this mutant strain, defective in the biosynthesis of the prenylated benzoate moiety, resulted in the formation of 32 new aminocoumarin compounds which were isolated on a preparative scale. The structures of these compounds were elucidated using FAB-MS and 1H-NMR spectroscopy. The high number of novel substances obtained from these experiments is most important as it demonstrates the value of mutasynthetic approaches for the development of new aminocoumarin antibiotics. These novel clorobiocin derivatives, were investigated for their antimicrobial activity against various Gram-positive and Gram-negative microorganisms and for inhibition of DNA gyrase activity. The test compounds differed with respect to the benzoate moiety attached to the ADHC-ring, the presence or absence of a 5-methyl-1H-pyrrole-2-carboxyl substituent and the site of attachment of this substituent to L-noviose, and the presence or absence of a chlorine atom at C-8 of the ADHC-ring. Clorobiocin showed lowest MIC values, exceeding those for novobiocin. Several novel substances showing activities similar to novobiocin may serve as leads for further drug development. Repositioning the 5-methyl-1H-pyrrole-2-carboxyl moiety from 3”-O to 2”-O of L-noviose, or removal of the chlorine atom from C-8 of the ADHC-ring, each reduce bioactivity two- to fourfold, whereas removing the methyl group from 4”-O of L-noviose resulted in nearly complete loss of antibiotic activity. By these studies I could clearly demonstrate the important role of substituents of the aminocoumarin core towards the antimicrobial activity and inhibition of E. coli DNA gyrase of clorobiocin and its derivatives.