Molekularbiologische und biochemische Untersuchungen zu Resistenzmechanismen der Aminocoumarinantibiotika-Produzenten und zur Amidsynthetase CouL aus Streptomyces rishiriensis DSM 40489

Abstract

Die Aminocoumarinantibiotika Novobiocin, Clorobiocin und Coumermycin A1 werden von verschiedenen Streptomyces-Arten produziert. Novobiocin wurde in den USA als Reserveantibiotikum (Albamycin®) zur Behandlung schwerer Infektionen insbesondere mit multiresistenten Staphylokokken zugelassen. Aminocoumarine sind Hemmstoffe der bakteriellen Gyrase. Ihr Angriffspunkt ist die B-Untereinheit dieses Tetramers aus zwei A- und zwei B-Untereinheiten. Im ersten Teil der Arbeit sollten mögliche Resistenzgene der Aminocoumarin-Produzenten identifiziert und ihre resistenzverleihende Eigenschaft gegen Aminocoumarine durch heterologe Expression belegt werden. Dazu wurden die Biosynthesegencluster von Novobiocin, Clorobiocin und Coumermycin A1 untersucht. Alle drei Cluster enthielten ein Resistenzgen gyrBR, das für eine GyrB-Untereinheit codiert. In den Clustern von Clorobiocin und Coumermycin wurde zusätzlich ein zweites, ähnliches Gen (parYR) gefunden. Sequenzanalysen ließen zwar darauf schließen, dass es sich dabei um ein Gen für eine B-Untereinheit einer Typ-II-Topoisomerase handelt, jedoch war eine eindeutige Zuordnung zur Gyrase oder Topo IV nicht möglich. Die Expression von gyrBR in Streptomyces lividans TK24 resultierte in hoher Resistenz der Transformanden gegen Novobiocin und Coumermycin A1. Die minimale Hemmkonzentration (MIC) für Transformanden mit gyrBR lag bei über 750 µg/ml für Novobiocin (WT 50-100 µg/ml) und bei 500 µg/ml für Coumermycin A1 (WT 50 µg/ml). Die durch parYR verliehenen Resistenzen waren mit einer MIC von 500 µg/ml Novobiocin und 300 µg/ml Coumermycin A1 etwas geringer. Durch Southern-Blot-Experimente mit gyrBR und parYR als Sonden konnte gezeigt werden, dass die Produzenten der Aminocoumarinantibiotika jeweils zusätzlich eine weitere Kopie dieser Gene besitzen. Dabei handelt es sich vermutlich um die Gene für sensitive Varianten von GyrB und ParY. Auch im Genom von S. coelicolor konnte jeweils ein hybridisierendes Gen detektiert werden. Im Novobiocin- und im Coumermycin-A1-Produzenten konnten die möglichen Transporter-Gene novA und couR5 identifiziert werden. novA zeigt Ähnlichkeit zu ABC-Transportern und couR5 zu Transmembran-Proteinen. Die Expression dieser Gene in S. lividans TK24 resultierte in moderater Resistenz gegen Novobiocin (MIC novA: 250-500 µg/ml; couR5: 250 µg/ml) und Coumermycin A1 (MIC novA: 250 µg/ml; couR5: 250 µg/ml). Diese Proteine sind also möglicherweise am Auswärtstransport der Sekundärstoffe aus der Zelle beteiligt. GyrBR und ParYR wurden als Histidin-Fusionsproteine in S. lividans T7 überexprimiert und mittels Nickel-Affinitätschromatographie gereinigt. Als A-Untereinheiten wurden GyrA und ParX aus S. coelicolor auf die gleiche Weise gereinigt. Der Komplex aus GyrA und GyrBR zeigte in vitro deutlich die erwartete Supercoiling-Aktivität bakterieller Gyrasen. Relaxation und Decatenierung von DNA konnten nicht nachgewiesen werden. Der Komplex aus ParX und ParYR zeigte in Abhängigkeit von ATP ausgeprägte Decatenierungs-Aktivität sowie Relaxations-Aktivität. Supercoiling-Aktivität konnte nicht nachgewiesen werden. Damit konnte erstmals der funktionelle Nachweis für eine Topoisomerase IV eines Organismus' aus der Klasse der Aktinobakterien erbrachte werden. Dies ist auch die erste Demonstration der Bildung einer Topo IV als Resistenzmechanismus eines Antibiotika-Produzenten und unterstreicht die Rolle der Topo IV als Zielmolekül der Aminocoumarinantibiotika. Die Organisation der Gene für ParX und ParY in den Aktinobakterien, die eine Topo IV besitzen, unterscheidet sich von der Organisation von parC und parE in anderen grampositiven Bakterien. Im zweiten Teil der Arbeit sollte die Bildung der beiden Amidbindungen in der Biosynthese des Coumermycins aufgeklärt worden. Das Cluster von Coumermycin A1 enthält ein putatives Amidsynthetase-Gen, couL, das für ein Protein aus 529 Aminosäuren codiert. CouL wurde als C-terminales Hexahistidin-Fusionsprotein in E. coli überexprimiert und mittels Nickel-Affinitätschromatographie nahezu homogen gereinigt. In vitro konnte der Nachweis erbracht werden, dass CouL beide Amidbindungen zwischen der 3-Methylpyrrol-2,4-dicarbonsäure und zwei Aminocoumarin-Einheiten bildet. Durch Gelfiltrationschromatographie konnte ein Molekulargewicht von 59-60 kDa für das rekombinante Protein ermittelt werden, was zeigt, dass CouL als Monomer aktiv ist. Die Amidsynthetase-Aktivität war abhängig von der Anwesenheit von ATP und Mn2+ oder Mg2+. Der Reaktionsverlauf zeigte die typische Michaelis-Menten-Kinetik, und es konnten Km-Werte von 26 µM für die 3-Methylpyrrol-2,4-dicarbonsäure und 44 µM für Ring B ermittelt werden. Einige Analoga der Methylpyrroldicarbonsäure wurden ebenfalls als Substrate akzeptiert. Pyridincarbonsäuren wurden dagegen nicht akzeptiert. 3-Dimethylallyl-4-hydroxybenzoesäure, die Acyl-Komponente des Novobiocins, wurde trotz der großen strukturellen Unterschiede zum natürlichen Substrat von CouL zu Novobiocinsäure umgesetzt.

The aminocoumarin antibiotics like novobiocin, clorobiocin and coumermycin A1 are produced by various Streptomyces strains. Novobiocin has been licensed in the USA for the treatment of serious infections especially with multiresistant Staphylococci. Aminocoumarins are inhibitors of the bacterial DNA gyrase by interaction with the B subunit of this tetrameric enzyme consisting of two A and two B subunits. The first task of my thesis was to identify putative resistance genes of the aminocoumarin producers, and heterologous expression of the respective genes. The biosynthetic gene clusters of novobiocin, clorobiocin and coumermycin A1 were investigated. All three clusters contained a resistance gene gyrBR, coding for a gyrase B subunit. The clusters of clorobiocin and coumermycin A1 were found to contain an additional, similar gene named parYR. Its predicted gene product showed sequence similarity with the B subunit of type II topoisomerases. Expression of gyrBR in Streptomyces lividans TK24 resulted in high resistance against novobiocin and coumermycin A1. The minimal inhibitory concentration (MIC) for transformants with gyrBR was greater than 750 µg/ml novobiocin (wild type 50-100 µg/ml) and 500 µg/ml coumermycin A1 (wild type 50 µ/ml). Resistance conferred by parYR was slightly lower and MICs were 500 µg/ml novobiocin and 300 µg/ml coumermycin A1, respectively. Southern hybridization experiments showed that the genome of all three antibiotic producers, and of Streptomyces coelicolor, contained two additional genes, which hybridized with either gyrBR or parYR, and which may code for aminocoumarin-sensitive GyrB and ParY proteins. Two putative transporter genes, novA and couR5, were found in the novobiocin and the coumermycin A1 cluster, respectively. Expression of these genes in S. lividans TK24 resulted in moderate levels of resistance against novobiocin (MIC novA: 250-500 µg/ml; couR5: 250 µg/ml) and coumermycin A1 (MIC novA: 250 µg/ml; couR5: 250 µg/ml), suggesting that these genes may be involved in antibiotic transport. GyrBR and ParYR, as well as the corresponding A subunits GyrA and ParX of S. coelicolor were overexpressed as hexahistidine fusion proteins in S. lividans T7 and purified by metal affinity chromatography. Reconstitution of the holo enzymes was achieved by mixing the corresponding subunits in vitro. The complex of GyrA and GyrBR was found to catalyze ATP-dependent supercoiling of DNA, i.e. to function as gyrase. No relaxation and decatenation activity was detected. The complex of ParX and ParYR catalyzed ATP-dependent decatenation and relaxation, i.e. the functions of topoisomerase IV (topo IV). This represents the first topo IV identified in the class of actinobacteria. At the same time, it is the first demonstration of the formation of a topo IV as a resistance mechanism of an antibiotic producer, underlining the role of topo IV as target for aminocoumarin antibiotics. The organization of parX and parY in actinobacteria which contain a topo IV is different from the organization of parC and parE on other Gram-positive bacteria.

The task of the second part of my thesis was to investigate the formation of the two amide bonds throughout the biosynthesis of coumermycin A1. The biosynthetic gene cluster of coumermycin contains a putative amide synthetase gene, couL, encoding a protein of 529 amino acids. CouL was overexpressed as hexahistidine fusion protein in E. coli and purified by metal affinity chromatography, resulting in a nearly homogenous protein. CouL catalyzed the formation of both amide bonds of coumermycin A1, i.e. between the central 3-methylpyrrole-2,4-dicarboxylic acid and two aminocoumarin moieties. Gel exclusion chromatography showed that the enzyme is active as a monomer with a molecular weight of 59-60 kDa (calculated 58.9 kDa). The activity was strictly dependent on the presence of ATP and Mn2+ or Mg2+. The apparent Km values were determined as 26 µM for the 3-methylpyrrole-2,4-dicarboxylic acid and 44 µM for the aminocoumarin moiety, respectively. Several analogues of the pyrrole dicarboxylic acid were accepted as substrates. In contrast, pyridine carboxylic acids were not accepted. 3-Dimethylallyl-4-hydroxybenzoic acid, the acyl component in novobiocin biosynthesis, was well accepted, despite its structural difference to the genuine acyl substrate of CouL.