Biochemische und zellbiologische Charakterisierung des cytokinesespezifischen Syntaxins KNOLLE und seiner Interaktoren

Abstract

Das cytokinesespezifische Syntaxin KNOLLE spielt während der Zellteilung in Arabidopsis eine essentielle Rolle. Seine Aufgabe besteht in der Fusion von Membranvesikeln in der Teilungsebene. Zur Funktion der Syntaxine gibt es zwar zahlreiche Erkenntnisse aus tierischen Systemen und Hefe, ein KNOLLE-homologes Protein ist jedoch nicht bekannt. Somit nimmt KNOLLE eine Sonderstellung unter den bekannten Syntaxinen ein, dessen Aufgabe sich ausschließlich auf die pflanzliche Cytokinese beschränkt. In der vorliegenden Arbeit wurde untersucht, in wie weit die in-vitro nachgewiesenen Interaktionen von Syb4, KEULE und SNP33 mit KNOLLE die Situation in vivo widerspiegeln. Es konnte gezeigt werden, dass das putative Synaptobrevin Syb4 ein ER-residentes Protein ist, dessen subzelluläre Verteilung durch die Inhibierung der Sekretion nicht beeinflusst wird. Im Gegensatz zu KNOLLE ist Syb4 konstitutiv exprimiert. Die dargestellten Untersuchungen zur subzellulären Lokalisation von Syb4 schließen eine Interaktion mit KNOLLE weitgehend aus und widersprechen den in-vitro gewonnenen Daten. Für die detaillierte Analyse der Interaktion von KNOLLE mit KEULE sowie für die Lokalisation von KEULE konnten durch die Etablierung verschiedener transgener Pflanzenlinien wichtige Vorarbeiten geleistet werden. Durch Expression von punktmutiertem KNOLLE wird es möglich sein, die Bedeutung einer postulierten Interaktionsstelle für die KNOLLE/KEULE-Wechselwirkung zu untersuchen. Zur Identifikation weiterer Interaktoren von KNOLLE wurden KNOLLE-enthaltende Proteinkomplexe angereichert. In nativen Mikrogelen konnte ein KNOLLE-Komplex mit einem apparenten Molekulargewicht von ca. 180kDa dargestellt werden. Der Nachweis von Myc-SNP33 in den aufgereinigten Proteinkomplexen belegt erstmals die direkte Interaktion mit KNOLLE in vivo. Somit konnte eine direkte Interaktion von SNP33 mit KNOLLE bestätigt, für Syb4 dagegen ausgeschlossen werden. Für weitere Analysen der KNOLLE/KEULE-Interaktion wurden wichtige Vorarbeiten geleistet.

The cytokinesis-specific syntaxin KNOLLE is an essential protein involved in the cell division of somatic Arabidopsis cells. KNOLLE is a key player of the membrane vesicle fusion in the division plane. Detailed information concerning the function of syntaxins is available from animals or yeast which, however, lack KNOLLE orthologous proteins. Thus KNOLLE is a unique syntaxin with its only function during plant cytokinesis. The aim of this thesis was to test the in-vivo significance of in-vitro interactions between Syb4, SNP33, KEULE and KNOLLE. The putative synaptobrevin Syb4 was shown to reside in the ER and its localization was not affected by the vesicle-trafficking inhibitor BFA. In contrast to KNOLLE, Syb4 is constitutively expressed, and the two proteins did not co-localize. These results rule out a direct interaction of Syb4 and KNOLLE and thus question the specificity of in-vitro interaction data. To study the KNOLLE/KEULE interaction, several transgenic plant lines were established. The expression of epitope-tagged KEULE will allow for subcellular protein localization while the expression of a mutated KNOLLE version provides a tool for analysing a postulated interaction site in KNOLLE. To identify new KNOLLE interactors, KNOLLE-containing protein complexes were enriched and analysed by non-denaturing micro-gel electrophoresis. KNOLLE is part of a complex of about 180 kDa. Myc-SNP33 copurified with KNOLLE, which provides direct evidence for interaction of SNP33 and KNOLLE in-vivo.