Anreicherung und In-line-Einschluss von Hyperforin aus Hypericum perforatum L. mittels überkritischer CO2-Extraktion

Abstract

Zubereitungen aus Johanniskraut (Hypericum perforatum L.) auf ethanolisch-wässriger Basis spielen eine große Rolle in der Behandlung leichter bis mittelschwerer depressiver Erkrankungen. Das Phloroglucinderivat Hyperforin konnte in zahlreichen Arbeiten als ein wichtiger wirksamkeitsmitbestimmender Inhaltsstoff nachgewiesen werden, es unterliegt jedoch bei herkömmlichen Extraktionsverfahren einem raschen lichtinduzierten, thermischen und oxidativen Abbau.

Ziel der vorliegenden Arbeit ist die selektive Anreicherung von Hyperforin aus Johanniskraut mittels überkritischer CO2-Extraktion und dessen Stabilitätsverbesserung durch In-line-Einschluss in beta-Cyclodextrine. Sämtliche Extraktionsversuche werden auf einer Anlage im Pilotmaßstab mit einem 1,2 l-Extraktionsbehälter durchgeführt. Zunächst wird der Einfluss des Extraktionsdruckes (90, 120 und 150 bar), der Extraktionstemperatur (40 und 50 °C, des CO2-Massenflusses (4, 8 und 12 kg CO2/h), der Extraktionsdauer (1, 3 und 5 h) und des Zerkleinerungsgrades der Droge auf das Extraktionsergebnis untersucht und das Extraktionsverfahren hinsichtlich Extraktausbeute, Hyperforingehalt der Extrakte, Restgehalt in der extrahierten Droge und Zersetzungstendenz von Hyperforin während der Extraktion optimiert.

Die Erhöhung des Extraktionsdruckes von 90 auf 120 bar führt in Folge einer erhöhten Dichte und damit verbunden einer gesteigerten Lösungskapazität zu einer Erhöhung der Extraktausbeute von 1,2 auf 2 %, bei einer Verringerung des Hyperforingehaltes von 35 auf 25 %. Eine Verlängerung der Extraktionsdauer von 1 auf 3 bzw. 5 h führt in Folge eines erhöhten Lösungsmittel-Droge-Verhältnisses zu einer gesteigerten Ausbeute von 1,7 auf 2,1 % und einer Verringerung der Hyperforingehalte von 32 auf 25 %. Höhere Lösungskapazitäten und gesteigerte Lösungsmittel-Droge-Verhältnisse führen zu einer verstärkten Extraktion unerwünschter Begleitstoffe wie beispielsweise Cuticularwachsen. Der CO2-Massenfluss zeigt keinen Einfluss auf das Extraktionsergebnis. Die Erhöhung der Extraktionstemperatur von 40 auf 50 °C bei konstanter Dichte hat eine Steigerung der Ausbeute von 1,9 auf 2,5 % zur Folge bei leicht verringertem Hyperforingehalt. Höhere Extraktionstemperaturen begünstigen jedoch die Zersetzung zu Orthoforin (syn. Furohyperforin), dem dominierenden Zwischenabbauprodukt von Hyperforin, erkennbar am vergrößerten Peakflächenverhältnis von Orthoforin/Hyperforin der Extrakte. Den gleichen Effekt auf das Peakflächenverhältnis Orthoforin/Hyperforin zeigt eine Zerkleinerung der Droge mittels Schneidmühle. Zieht man alle Effekte in Betracht, so erweist sich eine Extraktion bei 120 bar/40 °C/8 kg•h-1/1 h bei Einsatz von unzerkleinerter Droge als optimal.

Die anfallenden CO2-Extrakte weisen eine starke Inhomogenität auf und lassen sich in einen klebrig-braunen, hyperforinreichen und einen flockig-gelben wachsreichen Teil trennen. Der hyperforinreiche Teil repräsentiert die Hauptmasse des Extraktes und enthält 90 % des gesamten Hyperforins im Extrakt. Mittels gaschromatographischer Trennung und Flammenionisationsdetektion lassen sich die vier homologen n-Alkane C27, C29, C31 und C33 nachweisen und quantifizieren. Der Hauptanteil entfällt dabei auf C29-n-Alkan. Dies wird durch GC-MS-Untersuchungen bestätigt und auf diese Weise eine Reihe weiterer Bestandteile der Wachsfraktion identifiziert werden, die überwiegend den Cuticularwachsen zuzuordnen sind.

Durch Einsatz einer Zwischenabscheidestufe soll ein Großteil der Wachsfraktion im Zwischenabscheider anfallen und auf diese Weise die Selektivität des Extraktionsverfahrens für Hyperforin weiter gesteigert werden. Trotz einer Halbierung des Gehaltes an C29-n-Alkan in der Endabscheiderfraktion im Vergleich zu Extraktionen ohne Zwischenabscheidung ist der Gehalt an Hyperforin in der Endabscheiderfraktion unverändert bei 40 %.

CO2-Extrakte aus Hypericum perforatum L. zeigen während einer 24-wöchigen Lagerung bei +5 °C eine nur geringfügige Abnahme des Hyperforingehaltes auf 96 % des Ausgangsgehaltes, was auf eine Einbettung von Hyperforin in die lipophile Extraktmatrix zurückgeführt werden kann. Durch Zusatz verschiedener Cyclodextrine (beta-Cyclodextrin, 1,8-Methyl-beta-Cyclodextrin, Hydroxypropyl-beta-Cyclodextrin) in den Endabscheider vor der Extraktion werden die Möglichkeiten und Grenzen eines In-line-Einschlusses von Hyperforin untersucht. Hyperforin in den auf diese Weise hergestellten Komplexen erweist sich als instabiler als in den reinen CO2-Extrakten, was auf eine zu geringe Einschlussrate von ca. 30 % zurückgeführt werden kann.

Alles in allem stellt die Extraktion mittels überkritischem CO2 eine schonende Methode zur Anreicherung von Hyperforin dar. Während dem medizinischen Einsatz solcher hoch angereicherter CO2-Extrakte zulassungstechnische Hindernisse entgegenstehen, sind sie für pharmakologische Untersuchungen von großem Interesse.

Medicinal preparations from St John’s Wort (Hypericum perforatum L.) based on aqueous-ethanolic extracts are widely used in the treatment of mild depressive disorders. In various studies there was an evidence for the antidepressive efficacy of the phloroglucinol derivative hyperforin, an important constituent of St John’s Wort. Hyperforin is very unstable, underlying with conventional solvent extraction rapid light-induced, thermal and oxidative degradation.

The aim of the present study was the selective enrichment of hyperforin from St John’s Wort and its stabilization by formation of in-line-inclusion complexes with beta-cyclodextrines. Extractions were carried out on a pilot-scale batch extraction plant with a 1.2 l extraction vessel. The influence of extraction pressure (90, 120, 150 bar), extraction temperature (40, 50 °C), massflow rate (4, 8, 12 kg), extraction time (1, 3, 5 h) and particle size of the crude drug was examined, optimizing the extraction process with respect to extraction yield, hyperforin content of the extracts and drug residues and degradation tendency of hyperforin, as well.

Increasing the extraction pressure from 90 to 120 bar cause a higher solvent capacity and thus an increase of extraction yield from 1.2 to 2 % but a decrease of hyperforin content from 35 to 25 %. In the same way, an increase of extraction time from 1 to 3 or 5 h, results in a higher solvent-drug-ratio and thus an increased extraction yield from 1.7 to 2.1 % but a decrease of hyperforin content from 32 to 25 %. Higher solvent capacities and solvent-drug-ratios favour the extraction of unwanted accompanying compounds, e. g. cuticular waxes. Carbon dioxide massflow rate doesn’t affect the extraction results in any way. Increasing the extraction temperature from 40 to 50 °C at constant density of the supercritical fluid rises the extraction yield from 1.9 to 2.5 %, at slightly decreased hyperforin content. On the other hand side, higher extraction temperatures favour the degradation of hyperforin to orthoforin during the extraction, which can be derived from an increased peak area ratio orthoforin/hyperforin. Grinding the crude drug in a cutting mill has the same effect on the orthoforin/hyperforin peak area ratio. Regarding all effects, an extraction at 120 bar/40 °C/8 kg•h-1 using unground St John’s Wort turns out to be the optimum condition.

The crude CO2-extracts are very inhomogeneous. They can be easily separated into a sticky-brownish part, which is rich in hyperforin and into a rich in wax, light-yellowish part. The part which is rich in hyperforin represents the major mass of the extract and contains up to 90 % of its whole hyperforin. The four homologous n-alkanes C27, C29, C31 and C33 are determined and quantified by GC-FID analysis. C29-n-alkane represents the predominant constituent of the wax fraction. Other constituents of the wax fraction are indentified by GC-MS analysis and can be assigned to the ubiquitary cuticular waxes.

By using a two stage separation scheme a fractionation of the extract should be achieved, in order to increase the extraction process’ selectivity for hyperforin. Despite the content of C29-n-alkane in the final separation stage is divided in half compared to an extraction with only one separation stage, the hyperforin isn’t increased.

During a storage at 5 °C over 24 weeks, Hyperforin content of CO2-extracts from St John’s Wort is slightly reduced to 96 %, calculated on starting content, caused by an inclusion of hyperforin into the lipophilic extract matrix. The addition of various cyclodextrines (beta-cyclodextrine, 1,8-methyl-beta-cyclodextrine, hydroxypropyl-beta-cyclodextrine) into the separation vessel prior to the extraction examines the possibilities and limits of an in-line-inclusion of hyperforin. Because of too low inclusion rates of about 30 %, such inclusion complexes lead to no further stabilization of hyperforin.

All in all supercritical CO2-extraction is a gentle method for the enrichment of hyperforin. Whereas the medicinal use of such extracts limited by restrictions of admission, they are of great interest for pharmacological essays.