Isolierung und Charakterisierung von Staufen-enthaltenden Ribonucleoprotein-Komplexen aus Rattenhirn

Abstract

Zur Polarisierung von Zellen werden vielfach spezifische RNAs in bestimmte intrazelluläre Bereiche transportiert und anschließend lokal translatiert. Auch in Neuronen werden RNAs dendritisch lokalisiert; nähere Erkenntnisse fehlen aber bislang. In Dendriten wurden Ribonucleoprotein-Komplexe beschrieben, die einen Mikrotubuli-abhängigen Transport zeigen und das Säugerhomologe des D. melanogaster Staufen Proteins enthalten. Das Ziel der vorliegenden Arbeit war es, solche Staufen-enthaltenden Komplexe aus Rattenhirn biochemisch zu isolieren und zu charakterisieren. Zunächst wurde die zelluläre Verteilung beider Säugerhomologen Staufen1 und Staufen2 untersucht und die Staufen-enthaltenden Komplexe anschließend biochemisch gereinigt. Die Staufen Proteine liegen in ausgereiften Neuronen im Zellkörper und in den Dendriten vor. Im Soma colokalisieren beide mit dem ER, während sie in den Dendriten als feine Partikel in getrennten Komplexen vorliegen. Staufen bildet verschiedene hochmolekulare, lösliche Komplexe mit einem Molekulargewicht von 440 kDa bis über 2 MDa. Die 700 kDa Staufen1 Partikel sind Ribonucleoprotein-Komplexe, welche durch Entfernen der RNA teilweise zerfallen. Sie cofraktionieren in der Gelfiltration spezifisch mit zwei dendritisch-lokalisierten RNAs, brain cytoplasmic RNA 1 und der a-Untereinheit der Calcium/Calmodulin-abhängigen Protein Kinase II, sowie mit der schweren Kette des Kinesins, einem Mikotubuli-assoziiertem Motorprotein. Beide Staufen Proteine kommen in Hirngewebe und Neuronen der Ratte in verschiedenen Isoformen vor, welche teilweise RNA abhängig mit ihren Interaktionspartnern in Wechselwirkung treten. Während Staufen163 und Staufen252 weitgehend in löslichen Komplexen vorliegen, sind Staufen155, Staufen259 und Staufen262 mit rER und Polysomen assoziiert. Mit der von mir etablierten Isolierung der Staufen-enthaltenden Ribonucleoprotein-Komplexe aus Rattenhirn gelang erstmals die Identifizierung von zwei dendritisch-lokalisierten RNAs, die von Staufen1 spezifisch erkannt werden könnten. Aufgrund der vorliegenden Daten erscheint ein Transport dieser Partikel über einen Kinesinmotor sehr wahrscheinlich.

A common mechanism of cell polarisation is the transport of specific RNAs to distinct intra-cellular compartments, where they are locally translated afterwards. In neurons specific RNAs are dendritically localised, but detailed information is still missing. In Dendrites ribonucleo-protein complexes showing a microtubule-dependent transport and containing the mammalian homolog of the D. melanogaster Staufen protein have been described. The aim of the present study was, to isolate such Staufen-containing complexes biochemically and to characterise them. The cellular distribution of both mammalian homologs Staufen1 and Staufen2 was firstly exa-mined and afterwards the Staufen-containing complexes were biochemically isolated. Both Staufen proteins are present within the cell body and the dendrites of fully polarised neu-rons. In the soma they colocalise with the ER, whereas in dendrites they are present in distinct complexes, distributed in fine particles. Staufen is forming different kinds of soluble high molecular complexes with a molecular weight of 440 kDa to over 2 MDa. The 700 kDa Staufen1 particles are ribonucleoprotein com-plexes, which are disrupted partially, if the RNA is removed. In gel filtration experiments, the complexes cofractionate specifically with two dendritic-localised RNAs, brain cytoplasmic RNA 1 and Calcium/Calmodulin kinase II-alpha, as well as with kinesin heavy chain, a micro-tubule-associated motor protein. Both Staufen proteins are present in different isoforms in rat brain tissue and neurons, which interact partially RNA mediated whith their partners. Whereas Staufen163 and Staufen252 are mainly found in soluble complexes, Staufen155, Staufen259 und Staufen262 are associated with rER and polyribosomes. With the within this thesis established isolation of the Staufen containing ribonucleoprotein complexes from rat brain, it was, for the first time, possible to identify two dendritic-localised RNAs, which could be recognized by Staufen specifically. The present data suggest, that a kinesin motor mediates the transport of the ribonucleoprotein particles.