Einsatz optischer Biosensoren für die Protein- und Fermentationsanalyse

Abstract

Diese Arbeit beschreibt den Aufbau und die Charakterisierung eines optischen Biosensors für die Prozesskontrolle biotechnologischer Prozessen. Als Detektionsmethode kommt die Reflektometrische Interferenzspektroskopie (RIfS) zum Einsatz. Diese Methode erlaubt eine markierungsfreie, zeitaufgelöste Beobachtung von Wechselwirkungsprozessen. Am Beispiel der Fermentation des Glycopeptidantibiotikas Vancomycin wird gezeigt, dass die Reflektometrische Interferenzspektroskopie auch für eine produktspezifische Analytik von Fermentationsprozessen geeignet ist. Dabei wird die spezifische Wechselwirkung zwischen Vancomycin und Peptiden, die mit der Sequenz D-Alanin-D-Alanin enden, für eine gezielte Detektion von Vancomyin ausgenutzt. Um schnell auf ungewollte Änderungen im Fermentationsprozess reagieren zu können, wird ein besonderes Augenmerk auf eine möglichst geringe zeitliche Verzögerung zwischen Fermentationsprozess und Analysenergebnis gerichtet. Dazu wird eine vereinfachte und damit schnell durchzuführende Probenvorbereitung entwickelt, die aus einfachen Filtrations- und Verdünnungsschritten besteht. Die daraus resultierenden erhöhten Anforderungen an das Sensorsystem werden durch den Aufbau eines Systems zur Online-Referenzierung gelöst. Eine Überprüfung der mit RIfS erhaltenen Daten mit Hilfe klassisch-analytischer Methoden wie HPLC-UV zeigt, dass mit RIfS nicht nur die Konzentration an Vancomycin, sondern vielmehr die antibiotische Aktivität der Probe bestimmt wird. Der Vergleich der RIfS-Daten mit Daten aus einem Hemmhoftest bestätigt dies. Aufgrund der Komplexität eines Fermentationsprozesses reicht eine einfache quantitative Analyse oftmals nicht aus, um den Fermentationsprodukte ausreichend zu charakterisieren. Eine Kopplung der Reflektometrischen Interferenzspektroskopie mit der Massenspektrometrie erlaubt neben der Quantifizierung von Komponenten auch deren Identifizierung und liefert damit einen deutlich höheren Informationsgehalt. Eine solche RIfS-MS-Kopplung wird in der vorliegenden Arbeit erstmals realisiert.

This work describes the development and characterisation of an optical biosensor used for the process control of biotechnological processes. As a detection method we use the reflectometric interference spectroscopy (RIfS). This method allows label-free and time-resolved monitoring of interaction processes. Using the fermentation of the glycopeptide antibiotic vancomycin as an example, it is shown that reflectometric interference spectroscopy is also suitable for a product-specific analysis of fermentation processes. The specific interaction between vancomycin and peptides ending with the sequence of D-alanine-D-alanine is used for the detection of vancomycin. To react quickly on unexpected changes during the fermentation process special attention is paid to keep the delay between fermentation process and analytical result as short as possible. Therefore a simplified and thus fast sample preparation is developed, consisting of simple filtration and dilution steps. The development of an online referencing system meets the resulting higher demands on the sensor-system. The verification of the RIfS data using standard analytical methods like HPLC-UV shows that when using RIfS, not only the concentration of vancomycin, but also the antibiotic activity of the sample is measured. This is also verified by comparing the RIfS data with a biological inhibition assay. Due to the complexity of fermentation processes a simple quantitative analysis often is not enough for a sufficient characterisation of the fermentation products. Coupling RIfS with mass spectrometry allows not only quantification of components, but also their identification. This is the first time that RIfS-MS coupling is described.