Immobilisierung von Enzymen auf Polyestervliesen und deren Anwendungen

Abstract

Am Beispiel des Papierspaltverfahrens wird die praktische Anwendung von auf Polyestervlies immobilisierten Proteasen untersucht. Da die relativ unpolare Trägeroberfläche des Vlieses die Langzeitstabilität des Enzymes (Trypsin) verschlechtern kann, werden Spacer-Moleküle eingesetzt, um das Trypsin von der Vliesoberfläche abzuschirmen. Es kommen der relativ hydrophile Spacer Polyethylenglykol-Diamin (PEG-Diamin), ein Dextran-Spacer und ein Protein-Spacer (BSA) zum Einsatz. Bei den ersten Typen handelt es sich jeweils um lineare Ketten. Der Proteinspacer dagegen stellt ein sehr großes raumerfüllendes Molekül dar, das selbst durch das über ihn immobilisierte Enzym angegriffen werden könnte. Für die einzelnen Spacer wurden jeweils geeignete Synthesewege geprüft. Die Stabilität des über die verschiedenen Spacer immobilisierten Trypsins wurde in Hinblick auf den pH-Wert, die Temperatur, unpolare Lösungsmittel und wiederholten Einsatz untersucht. Durch NMR-Spektroskopie und Scanning Electron Microscope (SEM)-Aufnahmen wurde verfolgt, in wie weit die einzelnen Syntheseschritte, insbesondere die partielle Hydrolyse, Auswirkungen auf die Polymerstruktur des eingesetzten Polyester-Vlieses zeigen. Durch einen geeigneten Aktivitätstest wurde verfolgt, in wie weit das immobilisierte Trypsin für den Abbau von Gelatine herangezogen werden kann. Dazu wurde der Ninhydrintest auf die Untersuchung von Gelatine-Abbauprodukten als qualitative Methode angepasst. Die Gelatine-Abbauprodukte wurden durch chromatographische Methoden untersucht. Dazu wurden sowohl die Size-Exclusion-Chromatographie (SEC) als auch die Hochleistungsflüssigkeitschromatographie (HPLC) herangezogen. Durch Vergleiche von unverdauter und mit immobilisiertem Trypsin behandelter Gelatine lassen sich qualitative Aussagen über den Abbauprozeß treffen.

The immobilization of trypsin directly on polyester fleece FO 2413 as well as via PEG-diamine, aldehyde dextran, amino dextran and bovine serum albumine (BSA) spacers was investigated. It is well established that longer spacers are required for efficient immobilization of biospecific molecules to solid support materials. These minimize steric hinderance and environmental effects imposed by the surface properties of the matrices. The hydrophobic surface of the polyester fleece causes inactivation of the immobilized enzyme. Therefore, the above-mentioned spacers were employed not only to achieve a high amount of bound trypsin but also to immobilize trypsin in its active conformation. The trypsin activity was tested with the N-benzoyl-DL-arginine-p-nitroanilide hydrochlorid (BAPNA) substrate as well as with the azocasein substrate, whereas the amount of fixed trypsin was determined by BCA method. To characterize the properties of the different linked trypsin molecules, the thermal stability, pH stability and the behaviour in ethanol/water mixtures was investigated. Due to the highest activity values obtained with the BSA spacer, this system was characterized more thoroughly by testing the activity behaviour after repetitive use and various storage conditions. Immobilized trypsin shows a high thermal and pH stability. Furthermore it can be stored for several months without loosing its activity.