Parameteroptimierung für zwei Verfahren zur markierungsfreien Analyse biomolekularer Wechselwirkungen

Abstract

Ziel der vorliegenden Arbeit war es, die Charakterisierung der Wechselwirkung zwischen einem G-Protein-gekoppelten Rezeptor, der nur eingebettet in seine Membran funktionell bleibt, und seinem Liganden zu ermöglichen und mit geeigneten Methoden zu untersuchen. Eine solche Charakterisierung erfolgte mit Biosensoren bisher noch nicht befriedigend, da diese Proteine schwer in eine lösliche Form gebracht werden können, ohne dass sie ihre Funktionalität verlieren. Eine Messung aus der Membranpräparation war mit rein brechungsindexsensitiven Methoden bisher schwer durchführbar. Hierzu sollten nun verschiedene Biosensoren grundsätzlich untersucht und verglichen, und bezüglich ihrer Eignung für die genannte Problemstellung gegenübergestellt werden. Dabei sollte besonders die Methode der Reflektometrischen Interferenzspektroskopie (RIfS) auf ihre Eignung untersucht und zu diesem Zweck in den Gesamtzusammenhang optischer Biosensoren eingeordnet werden. Eine genaue Analyse der Leistungsparameter sollten im Vergleich zu bereits kommerzialisierten Verfahren eine Einordnung ermöglichen. Auch im Hinblick auf eine mögliche Kommerzialisierung der Methode RIfS sollten anhand höchster Anforderungen, gegeben durch die kinetische Charakterisierung eines Modellsystems, eine vergleichende Analyse gegenüber zweier ausgewählter kommerzialisierter und bekannter Technologien, der SPR und der Resonant-Mirror-Technik, repräsentiert durch das BIAcore 2000 und das IAsys plus, und ein Interferometersystem, das IBS 101 des IPM Freiburg, durchgeführt werden. Um die Leistungsparameter der RIfS abzuschätzen, sollte eine Signalkalibrierung anhand von spezifischer Bindung radioaktiv markierter Proteine durchgeführt werden. Um für das IBS 101, ein Prototyp eines Young-Interferometers, reproduzierbare Messungen der Wechselwirkungen von Biomolekülen zu ermöglichen, bestand jedoch zunächst die Notwendigkeit der Entwicklung einer organischen Schichtpräparation für eine reproduzierbare Immobilisierung von Biomolekülen an, welche innerhalb einer Kooperation gemeinsam mit einer Weiterentwicklung der Detektion und der Fluidik zum Bestandteil der Arbeit wurde.

A goal of the work was the characterization of the interaction between a G-protein-coupled receptor, which is only stable embedded in the membrane, and its ligand. An analysis with the most appropriate method should be performed. A characterization with biosensors is difficult because the receptors are hardly soluble without the loss of activity. Measurements out of a membrane preparation with refractive sensitive methods have been difficult. Within this work some biosensors should be investigated and compared in regard to their applicability for the problem. Especially the Reflectometric Interference Spectroscopy (RIfS) as a non-commercial method should be analysed and compared. It has to be proofed by the use of a model system that the RIfS instrument meets the higher requirements of a kinetic measurement. Comparing analyses of RIfS, Surface plasmon resonance (SPR) and resonant mirror (RM), represented by two commercial instruments (BIAcore and IAsys) and a young interferometer (IBS 101, Fraunhofer Intitute Freiburg) have been carried out. To estimate the performance of the RIfS instrument a calibration has been carried out by the use specific interaction of radioactive labelled proteins. For the prototype of the young interferometer, the IBS 101, it became essential first to develop an organic layer system in order to ensure a reproducible immobilization of ligands. Also a further development of the fluidic system and the detection device together with the IPM Freiburg became part of the dissertation.