Die Adenylatcyclase CyaB1 aus Anabaena sp. PCC 7120 ist ein cAMP-sensitives Protein

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URI: http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bsz:21-opus-7710
http://hdl.handle.net/10900/48466
Dokumentart: Dissertation
Date: 2003
Language: German
Faculty: 7 Mathematisch-Naturwissenschaftliche Fakultät
Department: Sonstige - Chemie und Pharmazie
Advisor: Schultz, Joachim E.
Day of Oral Examination: 2003-04-11
DDC Classifikation: 500 - Natural sciences and mathematics
Keywords: Adenylatcyclase , Anabaena cylindrica , Evolution
Other Keywords: GAF-Domänen , PAS-Domänen
GAF-domain , PAS-domain
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Inhaltszusammenfassung:

Das Gen CyaB1 aus dem Cyanobakterium Anabaena sp. PCC 7120 codiert für eine Adenylatcyclase, die aus zwei N-terminalen GAF-Domänen (GAF-A und GAF-B), einer PAS-Domäne, einer Klasse-IIIb-AC katalytischen Domäne und einer TPR-ähnlichen Domäne besteht. Die katalytische Domäne von CyaB1 wurde kinetisch charakterisiert und mit Punktmutationen wurden die durch Sequenzvergleiche vorhergesagten katalytischen Aminosäuren verifiziert. Mit Rekonstitutionsversuchen von Punktmutanten, die einzeln inaktiv sind, wurde die Bildung katalytisch aktiver Homodimere nachgewiesen. Die spezifische Aktivität des Holoenzyms stieg exponentiell mit der Inkubationszeit an, da das Reaktionsprodukt cAMP dosisabhängig und nukleotidspezifisch als Aktivator der enzymatischen Aktivität (EC50 bei 1 µM) fungiert. Damit wurde erstmalig cAMP als GAF-Domänen Ligand identifiziert. Punktmutationen in der GAF-A oder GAF-B Domäne von CyaB1 zeigten, dass für die Aktivierung eine Bindung von cAMP an die GAF-B Domäne erfolgt. Das cyanobakterielle GAF-Domänen Ensemble konnte gegen das GAF-A/-B-Ensemble der cGMP stimulierten Ratten-PDE-2 ausgetauscht werden und verwandelte CyaB1 in eine cGMP stimulierte Adenylatcyclase. Das demonstriert die funktionelle Konservierung des bewährten Prinzips der Aktivierung durch GAF-Domänen, das vor über 3 Milliarden Jahren entwickelt wurde und sich in alle Phyla ausbreitete.Weitergehende Versuch mit einzeln ausgetauschten oder deletierten GAF-Domänen sowie Chimären mit der mycobakteriellen AC Rv1625c zeigen, dass Tandem-GAF-Domänen nur als fein aufeinander abgestimmtes Ensemble funktionieren. In Cyanobakterien könnte CyaB1 als cAMP gesteuerter Nano-Schalter zur Stabilisierung einmal getroffener Entwicklungsentscheidungen dienen.

Abstract:

The gene cyaB1 from cyanobacterium Anabaena sp. PCC 7120 codes for a modular protein consisting of two N-terminal GAF (GAF-A and GAF-B) domains and a PAS and single class III adenylyl cyclase catalytic domain. The kinetics of the catalytic domain were characterised and the catalytic active amino acids were defined using point mutations. The adenylyl cyclase is active as a homodimer as demonstrated by reconstitution from complementary inactive point mutants. The specific activity of the recombinant and purified holoenyzme increased exponentially with time because the reaction product cAMP dose-dependently and nucleotide-specifically activated cyaB1 (half-maximally at 1µM). This established cAMP as a novel GAF domain ligand. Using inactivating point mutants of either GAF-A or GAF-B domain revealed that cAMP activated cyaB1 via the GAF-B domain. We replaced the cyanobacterial GAF domain ensemble in the cyaB1 adenylyl cyclase by the GAF-A/GAF-B assemblage from the rat cGMP-stimulated phosphodiesterase type 2. This way we converted the cyanobacterial adenylyl cyclase to a cGMP-stimulated adenylyl cyclase and established in principle the functional conservation of the GAF domain ensemble over more than 2 billion years since the divergence of bacterial and eukaryotic lineages. Further experiments using single GAF-domain deletionmutants and chimeric proteins with single PDE-2 GAF-domains or the catalytic domain of the mycobacterial adenylyl cyclase Rv1625c revealed that the GAF-domains work as a delicate fine tuned ensemble.

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