Entwicklung von Assaysystemen für die parallele Detektion biomolekularer Interaktionen an peptidfunktionalisierten Sensoroberflächen

Abstract

Kurzfassung in deutsch Mit der Entwicklung neuartiger Assaysyteme auf der Basis von peptidfunktionalisierten Oberflächen wurden neue Ansätze beim Einsatz von Biosensoren in der DNA-Analytik, Umweltanalytik sowie der medizinischen Diagnostik erarbeitet. Etabliert wurde zuerst eine Sensoroberflächen, welche auf der in der Antisense-Technologie entwickelten Peptidnukleinsäure (PNA) basiert. Dieses Peptid hat eine ähnliche räumliche Struktur wie die DNA, ist aber sehr viel stabiler. Die PNA-Oberflächen sind über mehr als 300 Regenerationsschritte und für mindestens ein halbes Jahr stabil. Anhand des direkt optischen Messsystems, der Reflektometrischen Interferenzspektroskopie (RIfS), wurden Vorteile der PNA-Oberflächen in der Gensensorik sowie bei einem im Arbeitskreis entwickelten Nukleaseassay aufgezeigt. Weiterhin konnten die Einsatzmöglichkeiten des Wasseranalysatorsystems (RIANA) mit Hilfe der so genannten flexiblen Immobilisierung erweitert werden. Mit PNA-Oberflächen, die bis zu sechs Monaten gelagert wurden, konnten drei unterschiedliche endokrine Substanzen quantifiziert werden. Damit wurde die Methode der flexiblen Immobilisierung auf der Basis von PNA-Oberflächen auf dem Multi-Spot-TIRF-Sensor implementiert. Diese Methode ermöglicht es, mehr Analyte als in dem portablen RIANA-System vorhandene Messspots nachzuweisen, ohne den Transducer aus dem System ausbauen zu müssen. Somit kann der Feldversuch von nicht geschultem Personal durchgeführt werden. Im Weiterem wurden stabile Peptidoberflächen mit hoher Beladung etabliert, welche zum Aufbau eines Assays zur Detektion von Antikörpern, die mit der Autoimmunerkrankung Zöliakie assoziierten werden, herangezogen wurden. Das lineare Epitop der Transglutaminase, das Autoantigen der Zöliakie, wurde untersucht. In einem Bindungshemmtest konnte die Peptidsequenz mit der höchsten Affinität zum Antikörper mit der parallelen, markierungsfreien Detektionsmethode, RIfS, gefunden werden. Im Einkanal-RIfS wurden anschließend die Affinitätskonstanten der relevanten Peptidsequenzen bestimmt. Mit dem im Epitopmapping gefundenen Peptid wurden mit der parallelen RIfS im Blutserum Antikörper detektiert. Um kleinere Probenmengen für die Antikörperdetektion im parallelen RIfS detektieren zu können, wurde die parallele RIfS-Methode miniaturisiert. Hierfür wurden neuartige Nanowells mit einem Durchmessers von 250 µm und einer Höhe von 500 µm hergestellt. Zur Befüllung der Wells wurde ein vorhandener miniaturisierter optischer Aufbau mit einem Pipettiersystem, welches 96 Tropfen im Nanoliterbereich parallel abgibt (TopSpot), kombiniert.

Development of novel assay systems based on surfaces, which are modified with peptides, offer new approaches to applications of biosensors in DNA-analytics, environmental monitoring and medical diagnostics. First, a sensor surface was established, which is based on peptide nucleic acid (PNA), that was developed in the antisense technology. This peptide has a spatial structure similar to DNA, however it is more stable. The PNA-surfaces are stable for more than 300 regeneration steps and for at least a half year. With the direct optical measuring system, the Reflectometric Interference Spectroscopy (RIfS), advantages of the PNA-surfaces, when used in gene-sensor-technology were pointed out as well as in a nuclease assay, that was developed in the workgroup. Furthermore the application of the water analyser system (RIANA) could be extended by using the flexible immobilization. With PNA-surfaces, which were stored up to six months, three different endocrine substances could be quantified. Thus the method of the flexible immobilization on the basis of PNA-surfaces was implemented on the multi-spot TIRF sensor. This method makes it possible to measure more analytes than the number of spots available in the portable RIANA-system, without changing the transducer. Now the field experiemts can be accomplished by untrained personnel. In the following stable peptide surfaces with high loading capacity were established. These surfaces were used for development of an assay for detection of antibodies associated with coeliac disease. The linear epitope of the Transglutaminase, the autoantigen of coeliac disease, was examined. In a binding inhibition assay the peptide-sequence with the highest affinity to the antibody could be found using the parallel, label-free detection method, RIfS. In the single channel RIfS system the affinity constants of the relevant peptide sequences were determined. Antibodies in blood serum were detected with this peptide. In order to use smaller sample quantity for antibody detection in the parallel RIfS, the parallel RIfS the method was miniaturized. To achieve this, novel nanowells with diameter of 250µm and a height of 500 µm were produced. An existing miniaturized optical assembly was combined with a pipetting system, which dispenses 96 drops in the nanolitre range in parallel (TopSpot), for filling the wells.