Klonierung und Charakterisierung einer Adenylatcyclase aus Plasmodium falciparum

Abstract

Untersucht wurde die an eine N-terminale Ionenkanaldomäne gekoppelte singuläre Adenylatcyclase (AC) aus Plasmodium falciparum. Die Arbeit beschreibt zunächst die Zuordnung der Exons, dann die Herstellung eines synthetischen Gens zur optimierten heterologen Expression. Die AC-Domäne wurde mit einem Baculovirus-Sf9-Expressionssystem als aktives Enzym exprimiert und durch Affinitätschromatographie gereinigt. Das Enzym verwendete ausschließlich ATP als Substrat, Guanylatcyclaseseitenaktivität war nicht meßbar. Kofaktor war Mn2+, Mg2+ unterstützte die Katalyse nicht. Die kinetische Charakterisierung deutet auf eine Homodimerbildung hin. Forskolin, ein Stimulator der meisten Säuger-ACn, zeigte keinen Effekt. Die Anwesenheit eines C-terminalen Tetratricopeptids (TPR) ist für die Bildung des löslichen aktiven Enzyms notwendig. Das Holoenzym war in Sf9-Zellen nicht aktiv exprimierbar, fluoreszenzmarkierte Konstrukte des Holoenzyms und der Kanaldomäne zeigten in anderen Metazoenzellen (CHO) eine intrazelluläre Retention. Fehlende Ionenströme bei der Expression des Holoenzyms in Oozyten lassen ebenso Retentionsprobleme vermuten. Dagegen scheint nach vorläufigen Ergebnissen bei heterologer Expression in Paramecium ein corticaler Transport des Holoenzyms möglich zu sein. Mit einem gereinigten Peptidantikörper gegen den C-Terminus wurde eine Immunlokalisation in Plasmodien durchgeführt. Dabei wurden vermutlich die Food vacuoles von späten Trophozoiten markiert. Westernblots hiervon erbrachten zwei spezifische Signale, welche jedoch ein größeres als das erwartete Molekulargewicht hatten. Durch Homologieklonierung (Tetrahymena-Genbankscreen) und Homologiesuchen (BLAST) wurden zusätzliche AC-Isoformen aus der Gruppe der Alveolata (Tetrahymena, Cryptosporidium, Toxoplasma und weitere Plasmodiumspezies) gefunden, konservierte Strukturen werden anhand von Sequenzvergleichen diskutiert.

This thesis describes studies of the singular ion channel adenylyl cyclase (AC) from Plasmodium falciparum. At the beginning the exon determination is described, subsequently a synthetic gene was manufactured for optimized heterologous expression. The isolated AC-domain was generated as an active enzyme in an Sf9-baculovirus expression system and purified by affinity chromatography. The exclusive substrate was ATP, guanylyl cyclase side-activity was not detected. Mn2+ was required as metal-cofactor, Mg2+ did not support activity. From the kinetic data a homodimerisation of the catalyst could be infered. Forskolin, a potent stimulator of most mammalian ACs, had no effect on enzyme activity. The C-terminal tetratricopeptide (TPR) was indispensable for formation of a soluble active enzyme. It was not possible to express the holoenzyme as an active entity in Sf9-cells, fluorescence tagged constructs of the channel domain alone or the holoenzyme were retained intracellularly in CHO-cells. The lack of a measurable ion conductance upon expression of the holoenzyme in Xenopus oocytes also indicated retention problems. In contrast to this, preliminary results from expression experiments in Paramecium indicate some transport of the holoenzyme to cortical regions. Immunolocalisaton in Plasmodium parasites was performed with a purified peptide antibody against the C-terminus of the holoenzyme. In late trophozoites food vacuoles appeared to be labeled. Western blotting of this parasite stage revealed two specific bands, both with a higher than expected molecular weight. Additional AC-isoforms from the parvkingdom of alveolata (Tetrahymena, Cryptosporidium, Toxoplasma and several members of the species Plasmodium) were detected by homology cloning (Tetrahymena libary screen) and homology searches (BLAST), conserved domains are discussed by sequence alignments.