Molekularer Mechanismus der Stickstoffmonoxid-vermittelten Akkumulation des Tumorsuppressors p53

Abstract

p53 und NO sind zwei Moleküle mit großer Bedeutung für den menschlichen Organismus. Beide beeinflussen den Zellzyklus und sind entweder Auslöser (NO) oder Vermittler der Apoptose. Seit Beginn der 90er Jahre ist bekannt, dass der Tumorsuppressor p53 unter Einfluss von NO akkumuliert. Dabei spielt es keine Rolle, ob NO exogen über NO-Donoren oder durch Stimulation endogener NO-Synthasen zugeführt wird. In der vorliegenden Arbeit wurde der molekulare Mechanismus der NO-vermittelten Akkumulation von p53 näher untersucht. Im Fokus der Studien stand die Degradation des Tumorsuppressors durch das Ubiquitin-Proteasom-System sowie dessen nukleär-cytoplasmatischer Transport. Es ist bekannt, dass p53 vorrangig über das Ubiquitin-Proteasom-System abgebaut wird. Dabei ist die Interaktion von p53 mit der E3-Ligase Mdm2 für seine Ubiquitinierung unerlässlich. Durch Co-Immunopräzipitationsversuche konnte gezeigt werden, dass p53 auch nach NO-Stimulation noch mit Mdm2 wechselwirkt. Dies ist interessanterweise trotz Phosphorylierung von p53 an Serin 15 der Fall, und steht im Gegensatz zu Daten, die auf einen Abbruch der Interaktion zwischen p53 und Mdm2 nach Serin 15-Phosphorylierung hinweisen. Ein Einfluss auf die Ubiquitinierung von exogenem HA-p53 und auch endogenem p53, wie er durch UV-Bestrahlung oder Hemmung des Proteasoms zu verzeichnen ist, konnte nach NO-Stimulation nicht festgestellt werden. Da weder die Bindung an Mdm2 noch die Ubiquitinierung von p53 nach NO-Stimulation beeinträchtigt war, wurde ein Einfluss der Serin 15-Phosphorylierung von p53 auf den nukleären Export vermutet. Durch Heterokaryon-Analysen konnte gezeigt werden, dass Serin 15-phosphoryliertes p53 nicht mehr in der Lage ist, den Kern zu verlassen. Aufgrund des gehemmten nukleären Exports von p53, in Korrelation mit der Phosphorylierung an Serin 15, kann dieses nicht mehr ins Cytoplasma gelangen, um dort vom Proteasom degradiert zu werden.

p53 and nitric oxide (NO) are two molecules with a high impact for the human organism. Both are influencing the cell cycle and induce/mediate apoptosis. Since the early nineties, it is known that the tumorsuppressor p53 accumulates in different cell systems under the impact of NO. Thus, it does not make any difference if NO is applied exogenously by NO-donors or generated endogenously via stimulation/induction of NO-synthases. In the present work the molecular mechanism of p53 accumulation under the impact of NO was examined in detail. In this study the degradation of p53 via the ubiquitin-proteasome system and the nucleo-cytoplasmic transport were focused. It is established that p53 is mainly degraded through the ubiquitin-proteasome system. Therefore, the interaction and ubiquitination of p53 through its E3-ligase Mdm2 is an important step. Interestingly, interaction between p53 and Mdm2 is not influenced by NO as shown by co-immunoprecipitation experiments. Moreover, p53 is found phosphorylated on serine 15 which is in contrast to data showing that this phosphorylation may block Mdm2/p53-interaction. An influence on the ubiquitination of exogenous HA-tagged p53 and also endogenous p53, as it is known for UV-irradiation or inhibition of the proteasome, could not be detected after NO-treatment. Since neither the interaction with Mdm2 nor the ubiquitination of p53 after NO-treatment were affected, an effect of the serine 15-phosphorylation of p53 on the nuclear export was assumed. Heterokaryon analysis, showed that serine 15-phosphorylated p53 is not able to shuttle between nucleus and cytoplasm. Due to inhibition of nuclear export of p53 correlating with serine 15-phosphorylation the proteasomal degradation of p53, which takes place in cytoplasm, is inhibited. This in turn leads to the accumulation of a predominantly nuclear localized p53.