Parapockenvirus (PPV) als neuartige Vektorvakzine : Entwicklung Pseudorabiesvirus (PRV)-spezifischer PPV-Rekombinanten und Untersuchung deren Immunogenität im Mausmodell

Abstract

Ziel der Arbeit war die Herstellung rekombinanter Parapockenviren der Spezies Orf Virus (ORFV), welche die hauptimmunogenen Pseudorabiesvirus (PRV)-Glykoproteine gB, gC + gD exprimieren. Hierfür wurde der zellkulturadaptierte, attenuierte ORFV-Stamm D1701 verwendet. Die Insertion der PRV-Glykoproteingene in das virale Genom erfolgte durch Substitution des frühen vegf-e-Gens, welches für einen Virulenzfaktor des ORFV kodiert. Die korrekte Insertion der Glykoproteingene gC + gD in das Genom der daraus resultierenden D1701-Rekombinanten und die in vitro Expression der Fremdgene in permissiven Vero-Zellen konnte nachgewiesen werden. Die Entwicklung einer PRV gB-spezifischen Rekombinante war bislang nicht erfolgreich. Die Prozessierung der ORFV-kodierten, herpesviralen Glykoproteine wurde anhand weiterer Rekombinanten mit Deletionen im Bereich der Signalsequenz bzw. der Transmembrandomäne des Glykoproteins gC genauer untersucht. Es wurde deutlich, daß bei der Entwicklung immunogener ORFV-Vektorvakzinen regulatorische Elemente der Genexpression in Eukaryontenzellen sowie strukturelle Eigenschaften des jeweiligen Fremdantigens zu berücksichtigen sind. Da die Maus eine potentiell nicht-permissive Wirtsspezies für die ORFV-Infektion darstellt, wurde die Genexpression und Replikation der D1701-Vektoren auch in Zellinien der Maus untersucht. Dabei konnte eine abortive Replikation des Virus nachgewiesen werden, was allerdings die frühe Expression der Vektor-kodierten Fremdgene in vitro nicht verhindert. Die intramuskuläre Immunisierung verschiedener Inzuchtmäusestämme mit den D1701-Rekombinanten ermöglichte einen soliden Schutz gegen die Infektion mit dem hochvirulenten PRV-Stamm NIA-3. Die Untersuchung der Vektor-induzierten, PRV-spez. Immunantwort in Wildtyp- und verschiedenen Knockout-Mäusestämmen deutet auf eine protektive Funktion PRV-Glykoprotein-spezifischer IgG-Serumantikörper zu einem frühen Zeitpunkt nach der Infektion hin.

The aim of this study was the construction of recombinant parapoxviruses of the species Orf virus (ORFV), which express the major immunogenic Pseudorabiesvirus (PRV)-glycoproteins gB, gC and gD. To this end, the cell culture adapted, attenuated ORFV strain D1701 was used. Insertion of the PRV glycoprotein genes was achieved by substitution of the early vegf-e gene, which encodes an ORFV virulence factor. The correct insertion of the glycoprotein genes gC and gD into the genome of the resulting D1701 recombinants and the in vitro expression of the foreign genes in permissive Vero cells could be demonstrated. So far, the development of a PRV gB-specific recombinant failed. The processing of the ORFV encoded herpesviral glycoproteins was analyzed in more detail using additional recombinants with deletions in the signal sequence or the transmembrane domain of gC. It could be shown that regulartory motifs of gene expression in eukaryontic cells as well as structural properties of the individual foreign antigen have to be considered for the development of immunogenic ORFV vector vaccines. Since the mouse represents a potential non-permissive host for the ORFV infection, gene expression and replication of the D1701 vectors was also investigated in murine cell lines. An abortive replication of the virus could be demonstrated, which, however, did not impede the early expression of the vector encoded foreign genes in vitro. Intramuscular immunisation of various inbred mouse strains with the D1701 recombinants mediated solid protection against challenge infection with the highly virulent PRV strain NIA-3. Investigation of the vector induced PRV specific immune response in wild type- and various knockout mouse strains indicates that PRV glycoprotein specific IgG serum antibodies contribute to protection early after infection. For a solid long-term protection, however, further cellular immune mechanisms are necessary.