Entwicklung neuer Proteintransduktionssysteme zur Hemmung des Transkriptionsfaktors NF-kappaB

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dc.contributor.advisor Bock, Karl W. de_DE
dc.contributor.author Stroh, Christopher de_DE
dc.date.accessioned 2002-10-17 de_DE
dc.date.accessioned 2014-03-18T10:10:37Z
dc.date.available 2002-10-17 de_DE
dc.date.available 2014-03-18T10:10:37Z
dc.date.issued 2002 de_DE
dc.identifier.other 10236415X de_DE
dc.identifier.uri http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bsz:21-opus-6128 de_DE
dc.identifier.uri http://hdl.handle.net/10900/48410
dc.description.abstract In der vorliegenden Arbeit wurde der Einsatz der Proteintransduktionstechnologie zur Hemmung des Transkriptionsfaktors NF-kB untersucht. IkBa und das Rel-Protein p65 ohne Transaktivierungsdomäne (p65DTAD) sollten durch Fusion mit dem HSV-1-Protein VP22 in Zellen eingeschleust werden. VP22 und VP22-Fusionsproteine werden nicht nur nach exogener Zugabe spezifisch intrazellulär aufgenommen, sondern sind auch zur transzellulären Migration (spread) fähig. Dabei wandern die Proteine aus transfizierten Produzentenzellen in nicht-transfizierte Zellen ein, wodurch eine annähernd 100ige Transfektionseffizienz erreicht wird. Expression von VP22-IkBa- und VP22-p65DTAD-Konstrukten in eukaryontischen Zellen führte zur Produktion großer Mengen rekombinanter Proteine und zur vollständigen Inhibition von NF-kB. Es wurde jedoch mit kein spread beobachtet. Inkubation von Zellen mit ungereinigten Lysaten von 293 Zellen, die VP22-IkBa exprimierten, führte zu einer spezifischen intrazellulären Aufnahme des Proteins und zur Hemmung von NF-kB. Dass VP22-IkBa nicht zum spread in der Lage war, aber nach exogener Zugabe in Zellen importiert wurde, beweist, dass Export und Import von VP22 zwei voneinander unabhängige Prozesse sind. Expression und Aufreinigung von VP22-IkBa in E. coli war möglich nach Reduzierung der VP22-Sequenz auf die C-terminale Hälfte (VP22D159) oder auf die C-terminalen 34 Aminosäuren (VP22D267). VP22D159- und VP22D267-IkBa wurden effektiv und spezifisch von Zellen internalisiert. Damit wurde nachgewiesen, dass die 34 C-terminalen Aminosäuren von VP22 für die Transduktion durch biologische Membranen ausreichend sind. Die Fusionsproteine waren jedoch nicht im Stande, NF-kB in vivo zu inhibieren. Die Aufreinigung von VP22-IkBa gelang durch baculovirale Expression. Hochreines VP22-IkBa wurde effektiv und spezifisch in Zellen aufgenommen, war aber im Gegensatz zu diesen gleichzeitig ein potenter Inhibitor der NF-kB-Aktivität sowohl in vitro als auch in vivo. de_DE
dc.description.abstract In the present thesis a possible application of the protein transduction technology to inhibit the transcription factor NF-kB was investigated. IkBa and the Rel protein p65 without transactivation domain (p65DTAD) the proteins were fused with the HSV-1 protein VP22. VP22 and VP22 fusion proteins are readily taken up into cells after exogenous administration and, moreover, they have the ability of transcellular migration (spread). During the latter process the expressed proteins translocate from transfected producer cells into non-transfected neighbour cells thereby achieving a transfection efficacy of virtually 100 Expression of VP22-IkBa and VP22-p65DTAD constructs in eukaryotic cells led to the production of large amounts of recombinant proteins and to complete inhibition of NF-kB. However, no intercellular spread of the fusion constructs was observed. Incubation of cells with crude lysates of 293 cells expressing VP22-IkBa led to a specific intracellular uptake of the protein and to inhibition of NF-kB. The fact that VP22-IkBa did not perform intercellular spread, but was imported into cells after exogenous application proofed that export and import of VP22 are two independent processes. Expression and purification of VP22-IkBa in E. coli was only possible after reduction of the VP22-sequence to the C-terminal half (VP22D159) or even to the C-terminal 34 amino acids (VP22D267). VP22D159- and VP22D267-IkBa were effectively and specifically internalised into cells which was the first proof that the 34 C-terminal amino acids of VP22 are sufficient for transduction through biological membranes. The imported fusion proteins were, however, not able to inhibit NF-kB. Baculoviral expression in Sf-9 cells enabled purification of full length VP22-IkBa. Highly purified VP22-IkBa was effectively and specifically taken up into cells. But moreover, they additionally proofed to be potent inhibitors of NF-kB activity in vitro and in vivo. en
dc.language.iso de_DE de_DE
dc.publisher Universität Tübingen de_DE
dc.rights ubt-nopod de_DE
dc.rights.uri http://tobias-lib.uni-tuebingen.de/doku/lic_ubt-nopod.php?la=de de_DE
dc.rights.uri http://tobias-lib.uni-tuebingen.de/doku/lic_ubt-nopod.php?la=en en
dc.subject.classification Nuklearfaktor Kappa B de_DE
dc.subject.ddc 540 de_DE
dc.subject.other Proteintransduktion , VP22 , I kappa B alpha de_DE
dc.subject.other protein transduction , VP22 , nuclear factor kappa B , I kappa B alpha en
dc.title Entwicklung neuer Proteintransduktionssysteme zur Hemmung des Transkriptionsfaktors NF-kappaB de_DE
dc.title Development of novel protein transduction systems to inhibit the transcription factor NF-kappaB en
dc.type Dissertation de_DE
dc.date.updated 1970-01-01 de_DE
dcterms.dateAccepted 2002-09-23 de_DE
utue.publikation.fachbereich Sonstige - Chemie und Pharmazie de_DE
utue.publikation.fakultaet 7 Mathematisch-Naturwissenschaftliche Fakultät de_DE
dcterms.DCMIType Text de_DE
utue.publikation.typ doctoralThesis de_DE
utue.opus.id 612 de_DE
thesis.grantor 14 Fakultät für Chemie und Pharmazie de_DE

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