Methyltransfer in Streptomyces viridochromogenes Tü57 - kleine Veränderung, bedeutender Effekt

Abstract

Avilamycine, gebildet von Streptomyces viridochromogenes Tü57, gehören zu den Orthosomycin-Antibiotika. Sie besitzen eine ausgezeichnete antibiotische Aktivität gegen Gram-positive, auch multiresistente Keime und gehören damit zu einer für die Entwicklung neuer Antibiotika interessanten Substanzgruppe. Im Rahmen dieser Arbeit wurde die Sequenzierung des Avilamycin-Biosynthesegenclusters abgeschlossen und nach Auswertung der erhaltenen Daten ein hypothetischer Biosyntheseweg erstellt. Der Schwerpunkt lag jedoch auf der funktionellen Charakterisierung der an der Biosynthese des Avilamycins beteiligten Methyltransferasen. Im Cluster konnten sechs mögliche Methyltransferasegene detektiert werden. Durch Geninaktivierungsexperimente konnten vier dieser Gene (aviG1, aviG2, aviG4 und aviG5) eindeutig als Methyltransferasegene identifiziert werden und eines (aviG3) als mögliche Isobutyryltransferase. AviG1 ist danach an der Biosynthese der 2-Desoxy-D-evalose beteiligt, AviG4 ist für die Methylierung der Hydroxylgruppe in der Dichloroisoeverninsäure verantwortlich, AviG2 für die Methylierung der Hydroxylgruppe an Position 6 der D-Mannose und AviG5 für die Methylierung an Position 4 der D-Fucose. Die durch die Inaktivierung der Methyltransferasegene erhaltenen neuen Avilamycinderivate wurden als Gavibamycine bezeichnet. Auch bei der Resistenzvermittlung im Produzenten S.viridochromogenes Tü57 spielen Methyltransferasen eine wichtige Rolle. Die beiden Gene aviRa und aviRb wurden in E.coli als N-terminale Hexa-Histidin-Fusionsproteine überexprimiert, gereinigt und in einem rRNA-Methylierungs-Assay eingesetzt. Dabei konnte für beide Enzyme rRNA-Methyltransferase-Aktivität nachgewiesen werden. Beide Enzyme methylieren jeweils verschiedene Positionen innerhalb der 23S rRNA. Wie sich in in-vitro-Translationsexperimenten herausstellte, sind beide Methylierungen notwendig, um den Ribosomen Resistenz gegenüber Avilamycin zu verleihen.

Avilamycins, produced by Streptomyces viridochromogenes Tü57, belong to the orthosomycin class of antibiotics. They inhibit the growth of multidrug-resistant Gram-positive bacteria and are therefore interesting compounds for the development of new antibiotics. In this work the sequencing of the avilamycin biosynthetic gene cluster was completed and after analysis of the sequence data a model for avilamycin biosynthesis was proposed. Main interest was the functional characterization of methyltransferases involved in avilamycin biosynthesis. Six putative methyltransferase genes could be detected in the cluster. Four of these genes (aviG1, aviG2, aviG4 and aviG5) could clearly be identified as methyltransferase genes by gene inactivation experiments and one (aviG3) as a possible isobutyryltransferase. Based on the results AviG1 is involved in 2-deoxy-D-evalose biosynthesis, AviG4 is responsible for methylation of the hydroxyl group of the dichloroisoeverninic acid moiety, AviG2 for methylation of the hydroxyl group at position 6 of the D-mannose moiety and AviG5 for methylation at position 4 of the D-fucose moiety. New avilamycin derivatives obtained by gene inactivation were named gavibamycins. Methyltransferases are also involved in the avilamycin resistance mechanism in the producer strain S.viridochromogenes Tü57. The two genes aviRa and aviRb were overexpressed as N-terminal hexahistidin fusion proteins in E.coli, purified to near homogeneity and used for rRNA methylation assays. For both enzymes rRNA methyltransferase activity could be confirmed. Both enzymes are methylating different positions of the 23S rRNA. As shown by in-vitro translation experiments both methyl groups are necessary to confer avilamycin resistance to the ribosomes.