Klonierung einer Adenylatcyclase aus Paramecium tetraurelia

Abstract

Der Versuch eine Adenylatcyclase (AC) aus Paramecium durch Homologieklonierung zu finden, führte zu einem Gen von 2595bp, dessen offener Leserahmen für ein Protein von 98 kDa kodiert. Datenbankanalysen ergaben, daß es sich um ein Multidomänenenzym handelt. Im N-terminalen Abschnitt finden sich 6 transmembranspannende Regionen (TM). Die TM4 entspricht einem kanonischen Spannungssensor mit sieben positiven Ladungen (K/RXXK/R...). C-terminal befindet sich ein cytosolischer Bereich, der Identitäten und Ähnlichkeiten mit einer Klasse III-AC besitzt. Die Ähnlichkeit ist besonders ausgeprägt zu homodimeren, bakteriellen ACn aus Anabaena oder Stigmatella. Zwischen dem Membrananker und der AC Domäne befindet sich ein Bereich, der eine klassische Kalium-spezifizierende Porenregion besitzt (GFGD). 30 Aminosäuren vor dem Carboxylende befindet sich ein Proteinabschnitt mit Ähnlichkeit zu einer Tetratricopeptidrepeateinheit (TPR). Wegen der Abweichung vom universellen genetischen Code und der unorthodoxen Codonverwendung durch Paramecium wurde das Gen mit einer Mammalia-Codonusage resynthetisiert. Die funktionelle Expression sowohl des Holoenzyms als auch von cytosolischen Proteinabschnitten scheiterte an der Bildung von 'inclusion bodies'. Es konnte keine AC-Aktivität nachgewiesen werden. Bei den Expressionsversuchen wurden folgende Systeme verwendet: E.coli, Streptomyces lividans, Rapid Translation System RTS500, HEK293, CHO-, OK- und Sf9-Zellen. Der Transport in die Plasmamembran von CHO- oder OK-Zellen durch Fusion mit den N-Termini der K+-Kanäle rSK2 und Kir2.1 bzw. dem ER-Export-Signal FCYENE von Kir2.1 war erfolglos. Die Herstellung von Antiseren gegen inclusion body-Proteine oder synthetische Proteine führte nicht zu einer befriedigenden Spezifität.

The attempt to clone an adenylyl cyclase (AC) from Paramecium by homology cloning lead to a gene of 2595bp. The open reading frame coded for 98 kDa Protein. Database analysis revealed a multi domain protein with six transmembrane spans in the N-terminal region including a canonical voltage sensor with seven positive charges and similarity to a potassium ion channel. The cytosolic carboxy-terminal region represents a class III AC-domain with similarity to homodimeric bacterial ACs such as from Anabaena or Stigmatella. 30 amino acids upstream of the C-terminus a domain with similarity to a tetratricopeptide repeat unit (TPR) is indicated. The complete Paramecium AC gene was resynthesized with a mammalian codon usage due to the aberrant genetic code in this ciliate. The functional expression of the holoenzyme or of cytosolic protein regions was impossible. Different expression systems were used such as: E.coli, HEK293, Rapid Translation System RTS500TM, Streptomyces lividans, Sf9-, CHO- and OK-cells. A transport of the expression product into the plasma membrane by fusion to the N-termini of the K+-channels rSK2 and Kir2.1 or to the ER-export-signal FCYENE of Kir2.1 was unsuccessful. The production of antibodies against the catalytic domain or an N-terminal hexadeca-peptide did not yield the specificity required for immunolocalization studies.