Histon-Desacetylasen der Klasse II : Entdeckung, Klonierung und funktionelle Charakterisierung der enzymatischen Aktivität einer neuen Gruppe humaner HDACs

Abstract

Histon-Desacetylasen (HDACs) spielen eine bedeutende Rolle bei der Regulation der Genexpression und der Chromatinstruktur. Eine hochkonservierte Domäne des transkriptionellen Repressors HDA1 in Hefe wurde verwendet, um vier neue humane Faktoren, HDAC4, HDAC5, HDAC6 und HDAC7, zu identifizieren und zu klonieren. Diese HDACs sind innerhalb einer C-terminalen Domäne mit Ähnlichkeit zu yHDA1 sehr homolog. Sie wurden deshalb zur Klasse II der humanen HDACs zusammengefaßt (Ähnlichkeit mit yRPD3, Klasse I; Ähnlichkeit mit ySir2, Klasse III). Im Gegensatz zu den HDACs der Klassen I und III zeigen die HDACs der Klasse II ein sehr begrenztes Expressionsmuster. HDAC4- und HDAC7-Proteine sind im Zellkern innerhalb diskreter Domänen angereichert. Unterschiedliche subzelluläre Verteilungen innerhalb verschiedener Zelllinien sowie Experimente mit Toxinen, die den nukleo-zytoplasmatischen Transport unterbinden, deuten darauf hin, daß HDACs der Klasse II zwischen Zellkern und Zytoplasma ausgetauscht werden. Spezifische Antikörper gegen HDAC4 und HDAC7 binden enzymatische Aktivitäten aus Extrakten unterschiedlicher Zelllinien, die zur Desacetylierung eines hyperacetylierten Peptids entsprechend des N-Terminus von Histon H4 führen. Ebenso weisen transient überexprimierte HDAC4-, HDAC5-, HDAC6- und HDAC7-Proteine derartige Histon-Desacetylasenaktivität auf. Rekombinante Fusionsproteine entsprechend der konservierten C-terminalen Domänen mit GST sind jedoch nur nach Inkubation mit Zellextrakten enzymatisch aktiv. Die detailierte Untersuchung der mit HDAC4 sowie HDAC7 assoziierten enzymatischen HDAC-Aktivitäten mittels Punkt- und Deletionsmutanten, chromatographischer Fraktionierung, Immunpräziptiation sowie Depletionsanalyse zeigt, daß diese Faktoren keine intrinsische Aktivität aufweisen. Sie sind vielmehr von der Bindung einer weiteren HDAC, HDAC3, abhängig. Diese Wechselwirkung der HDACs der Klasse II mit HDAC3 wird durch die Corepressorproteine N-CoR und SMRT vermittelt.

Histone deacetylases (HDACs) play a key role in regulating eukaryotic gene expression and chromatin structure. A highly conserved domain of the yeast transcriptional repressor HDA1 was used to identify and clone four new human factors, HDAC4, HDAC5, HDAC6 and HDAC7. These factors share a high degree of homology in a C-terminal domain as well as with yHDA1 and are therefore classified as HDACs of class II (homologues of yRPD3, class I; homologues of ySir2, class III). In contrast to HDACs of class I and III, the HDACs of class II show a rather distinct expression pattern. HDAC4 and HDAC7 are mainly nuclear proteins that accumulate in distinct subnuclear domains. However, differences in the subcellular distribution between different cell lines as well as preliminary observations using toxins that affect nucleo-cytoplasmatic transport indicate that these factors might shuttle in and out of the cell nucleus. Antibodies specific for HDAC4 and HDAC7 recover enzymatic activities from several cell lines which promote the deacetylation of a chemically hyperacetylated peptide corresponding to the N-terminus of histone H4 in vitro. Transiently overexpressed HDAC4, HDAC5, HDAC6 and HDAC7 display similar enzymatic histone deacetylase activity. However, recombinant fusion proteins of the highly conserved C-terminal domains with GST are only enzymatically active after incubation with cellular extracts. The detailed study of the enzymatic activities associated with HDAC4 and HDAC7 using deletion as well as point mutants, chromatographic fractionation, affinity purification and depletion analysis shows that these factors are not functioning independently. They are strictly depending on the association with another HDAC, HDAC3, for enzymatic activity. It is further shown that the corepressor proteins N-CoR and SMRT are crucial mediators of the interaction of HDACs of class II with HDAC3. The implications of these findings for the enzymatic activity of HDACs of class II are discussed.