Bioverfügbarkeit von Carotinoiden und deren Metabolisierung in Serum und Retina : Anwendung von HPLC-NMR- und HPLC-APCI-MS-Kopplung

Abstract

In der vorliegenden Arbeit wurden unterschiedliche Carotinoid Z/E-Stereoisomere von der Nahrungsquelle (Gemüse) über das Serum bis zum retinalen Gewebe, dem Wirkungsort für die altersbedingte Makula-Degeneration (AMD), quantitativ analysiert. Außerdem wurde eine HPLC-Methode zur Trennung optischer Zeaxanthinisomere entwickelt. Die Extraktion erfolgte schonend und artefaktfrei mit speziell zugeschnittenen Methoden. So wurden einerseits Carotinoide direkt aus den festen Gewebeproben mittels Matrix Solid Phase Dispersion (MSPD) extrahiert. Andererseits konnten Carotinoide aus Plasma unter Verwendung von Restricted Access Materialien ohne jegliche Probenvorbehandlung angereichert werden. Zur Identifizierung der geometrischen Isomere wurden die Methoden der HPLC-UV-, HPLC-MS- sowie der HPLC-NMR-Kopplung angewandt. Die Bioverfügbarkeit von Lutein aus in Deuteriumoxid hydroponisch angebautem, partiell deuteriertem Gemüse (Spinat und Kohl) wurde mittels HPLC-APCI-MS-Kopplung untersucht. Hierzu wurden Serumproben von Probanden vor und nach Applikation von mit Deuterium markiertem Gemüse analysiert. Als Ergebnis konnte die Aufnahme und Anreicherung des applizierten partiell deuterierten Luteins genau ermittelt werden, da dieses von im Organismus gespeichertem Lutein mittels Massenspektrometrie unterschieden werden kann. Die Bestimmung der Carotinoid-Stereoisomere am Wirkungsort der AMD, der Retina, wurde an verschiedenen Tiermodellen durchgeführt. Dabei wurde eine universell anwendbare Extraktionsmethode entwickelt, und das Carotinoid-Stereoisomerenpattern von Mensch, Affe, Huhn, Schwein und Ratte verglichen. Die Bestimmung der Stereoisomere erfolgte in unterschiedlichen retinalen Abschnitten (Makula Lutea, temporale und nasale Retina, Choroid, Pigmentepithel). Zur Untersuchung der Metabolisierung wurden am Tiermodell Huhn mit reinen Carotinoidisomeren Injektionen in den Glaskörper des Auges durchgeführt.

Several geometrical carotenoid Z/E isomers were quantitatively analyzed in different vegetables as their natural source, as well as in serum and retina, the sphere of activity for age-related macular degeneration (AMD). Besides, a method was developed for the separation of optical zeaxanthin isomers. A specially designed mild and artifact-free extraction was applied for the different analyses. On the one hand, the carotenoids from tissue samples were extracted employing Matrix Solid Phase Dispersion (MSPD) directly from the solid tissue. On the other hand, carotenoids were selectively enriched from plasma using Restricted Access materials without any pretreatment. The identification of the geometrical isomers was available by applying HPLC-UV-, HPLC-MS- as well as HPLC-NMR coupling. The bioavailability of lutein from partially deuterated vegetables (spinach, kale), hydroponically grown in deuterium oxide, was investigated by using HPLC-APCI-MS coupling. Here, serum samples were analyzed prior and after single ingestion of partially labeled vegetables. The absorption and enrichment of the applied deuterated lutein was exactly determined as it was possible to distinguish from the unlabeled lutein from the body storage using mass spectrometry. The determination of carotenoid stereoisomers in the retina was carried out with several animal models (humans, primates, chicken, pigs, rats). Hereby, a universally applicable extraction method based on MSPD was developed. The carotenoid stereoisomer pattern was determined in different sections of the retina (macula lutea, temporal and nasal retina, choroid, pigment epithelium). To gain insight in the metabolism of carotenoids pure carotenoid isomers were injected in the vitreous of chicken eyes.