Replikation an der Kernmatrix von SV40-infizierten CV1 Zellen

Abstract

Die Replikation von Simian Virus 40 (SV40) in infizierten CV1 Zellen läuft an der Kernmatrix ab. Durch kontrollierte Hypoxie läßt sich die SV40-Replikation in vivo synchronisieren. Dabei werden initiationsbereite SV40 Genome aufgestaut und erst nach nachfolgender Reoxygenierung synchron repliziert. Von derart synchronisierten SV40 infizierten CV1 Zellkulturen wurde die matrixassoziierte und damit DNaseI- bzw. Mikrokokkusnuklease-resistente DNA isoliert und analysiert. Ein Fortschreiten der SV40-Replikation sollte sich dabei in einer Veränderung der an die Kernmatrix gebundenen und damit verdaugeschützten SV40-Bereiche zeigen. Es wurden zunächst verschiedene Methoden der Präparation kernmatrixassoziierter SV40-Sequenzen untersucht. Dabei wurde durch Nukleasen und Hochsalzextraktionen ein Großteil der Nukleinsäuren und Proteine entfernt. Die so gewonnenen verdaugeschützten DNA-Bereiche wurden mit Hilfe von Agarosegelelektrophorese und anschließender Autoradiographie der getrockneten Gele oder mittels Southern Blotting auf Länge und Größenverteilung der DNA und des Anteils SV40-spezifischer Sequenzen in der Präparation untersucht. Durch die verschiedenen Präparationsverfahren wurden zwischen 95 und 99,9 der DNA abgetrennt. Es ergab sich, daß 95 der aufgereinigten, verdaugeschützten DNA eine Länge von über 2 kB hatten, während nur etwa 5 eine Länge zwischen 80 bis 250 bp besaßen. Die SV40-spezifische DNA bestand zum überwiegenden Anteil aus vollständigen Genomen. Das Auftreten von verschiedenen topologischen Formen und die Nukleaseresistenz zeigten, daß die verdaugeschützte und hochsalzresistente DNA vermutlich bereits in Virus-partikel verpackt vorliegt und daß diese Viruspartikel hochsalzresistent an der Proteinmatrix verankert sind. Nach Proteinase K-Behandlung war die Nukleaseresistenz verloren.

The replication of simian virus 40 (SV40) in infected CV1 cells occurs at the nuclear matrix. The replication of SV40 can be synchronized by controlled hypoxia in vivo by arresting 'ready-to-start' replicons, which will initiate replication synchronously after reoxygenation. In these experiments, matrix-associated and thereby nuclease-resistant DNA of SV40-infected CV1 cells was isolated and analyzed. During the process of replication, the matrix-associated and thereby nuclease-protected domains of SV40 DNA should change.

Different methods for the preparation of matrix-associated SV40 DNA sequences were examined. During the preparation the greatest part of the DNA and the nuclear proteins were removed by nucleases and high salt extraction. The remaining nuclease-protected DNA was examined for size and portion of SV40 specific sequences by electrophoresis and consecutive autoradiography of g[32P]-ATP endlabeled preparations and by southern blotting, respectively. Different methods removed between 95 and 99 of the DNA. 95 of this isolated, nuclease-resistant DNA had a length of more than 2 kB, whereas only 5 had a length of 80 to 250 bp.

The SV40-specific DNA was comprised mostly of complete viral genomes. Isolation of different topological forms and its nuclease resistance indicated, that the DNA most likely was already packed into viral particles and that these particles were anchored to the protein matrix. After treatment with proteinase K the DNA lost its nuclease resistance.

The nuclease-resistant DNA of euoxic (unsynchronized), hypoxic and for variable times reoxygenated (i.e. synchronized) SV40-infected CV1 cells was endlabeled with g[32P]-ATP and hybridized against membrane-bound and defined fragments of the SV40 genome. After normalizing the lengths of the membrane-bound SV40 fragments no significant differences could be detected in hybridization signals between the differently pretreated SV40-infected CV1 cells.