Untersuchung der Sequenzabhängigkeit von Dissoziationskonstanten von DNA- Oligomeren mittels Fluoreszenz-Kreuz-Korrelations-Spektroskopie

Abstract

Durch die Anwendung von FCCS- Messungen (Fluoreszenz Kreuz- Korrelations Spektroskopie) des konfokalen Mikroskops ist es möglich, DNA-Dissoziationskonstanten zu berechnen. Um die Detektion einer Bindung bei der Fluoreszenz-Korrelations-Spektroskopie zu erreichen, muß sich der Ligand in seinem Molekulargewicht stark von dem des Rezeptors unterscheiden, um eine Änderung der Diffusionskonstanten bei einer Bindung zu ermitteln. Im Gegensatz dazu ist es bei der Fluoreszenz-Kreuz-Korrelations-Spektroskopie möglich, die Änderung der Diffusionskonstanten von Molekülen mit gleichem Molekulargewicht zu bestimmen. Die Technik erlaubt es, in kleinen Probevolumina mit kleiner Konzentration (µM bis nM) zu messen. Das Objektiv fokussiert dabei das Laserlicht auf einen Punkt in der Probe. Es wird ein Probenvolumen von 1015 Liter (Femto-Liter) bestrahlt und die fluoreszenzmarkierten Moleküle, die sich in diesem Volumenkegel befinden, durch das Laserlicht angeregt. Durch das Messen der emittierten Fluoreszenz über eine bestimmte Zeit können anschließend die Partikelzahlen errechnet werden. Weiterhin lassen sich die Diffusionszeiten der Moleküle ermitteln. In unserem Versuch wurden verschiedene Sequenzen komplementärer DNA- Stränge (11mere), die mit zwei verschiedenen Fluorophoren - Cy5 und Rhodamin Green - markiert waren, untersucht. Die Messungen zeigten, daß nicht nur der G/C- und A/T- Gehalt der Sequenzen bei der Bestimmung der Dissoziationskonstanten eine wesentliche Rolle spielt, sondern auch die Sequenzabfolge des vermessenen 11mers. So wurde neben dem 11mer einer bestimmten Sequenz ein weiteres 11mer vermessen, dessen Basenabfolge eine spiegelbildliche zu der des ursprünglichen Oligonukleotids aufwies. Auch bei gleichem G/C- und A/T- Gehalt erhält man sowohl für die eine Sequenz als auch für die gespiegelte Sequenz unterschiedliche Dissoziationskonstanten. In diesem Zusammenhang ist noch zu ermitteln, ob der Einfluß der “Stacking forces” dafür verantwortlich ist.