Kinetische und thermodynamische Charakterisierung von einem monoklonalen Antikörper gegen Estradiol mit Oberflächenplasmonenresonanz

Abstract

Der monoklonale anti-Estradiol Antikörper 15H11 wurde charakterisiert, um sein Bindungsverhalten zu Estradiol und verwandten Analyten aufzuklären. Das Biacore 2000, das auf dem Prinzip der Oberflächenplasmonenresonanz (SPR) basiert, wurde als Hilfsmittel für alle Messungen benutzt. Die Charakterisierung von Reaktivität und Kreuzreaktivität des Antikörpers sollte dazu verwendet werden, einen kompetitiven homogenen Fluoro-immunoassay zu optimieren. Zwei verschiedene Derivate wurden auf dem Transducer immobilisiert, um das 15H11 IgG spezifisch zu binden. Diese immobilisierten Verbindungen waren Derivate von Estradiol, die eine Säuregruppe in Position 6 und 7 enthielten. Das Derivat E2-7-CMO war das Immunogen, gegen das der Antikörper ursprünglich entwickelt wurde. Bei kinetisch kontrollierter Bindung der Antikörper auf der Oberfläche wurden die Assoziations- und Dissoziationsratenkonstanten für E2-6-CMO bzw. E2-7-CMO mit 15H11 bestimmt. Damit konnten die Affinitätskonstanten zwischen Derivat und Antikörper bestimmt werden. Die Messungen wurden bei Temperaturen zwischen 10 und 30 °C durchgeführt, um die thermodynamische Größen, Enthalpie und Entropie zu ermitteln, die anzeigen, welcher Typ von Kräften für die Wechselwirkungen zwischen Analyt und Antikörper entscheidend ist. Die Affinitätskonstante zwischen dem Immunogen E2-7-CMO und dem Antikörper war bei jeder Temperatur höher als die zwischen E2-6-CMO und dem Antikörper. Die Affinität war sehr stark Entropie kontrolliert, was typisch für hydrophobe Wechselwirkungen ist. Unter Massentransport-kontrollierten Bedingungen wurden die aktive Konzentration von 15H11 sowie die Inhibitionskurven mit verschiedenen Analyten bestimmt. Die aktive Konzentration wurde für verschiedene eingesetzte Konzentrationen ermittelt. Die Ergebnisse dieser Messungen zeigten, daß das IgG mit zunehmender Verdünnung weniger aktiv war.