In-vitro Selektion von DNA-Molekülen für Schimmelpilz-Biosensoren

Abstract

Schimmelpilze in Innenräumen können bei den Bewohnern verschiedene Gesundheitsprobleme auslösen, wie beispielsweise Mykosen, Mykotoxikosen und Allergien. Standardmethoden für die Quantifizierung und Identifizierung der Pilze sind oft zeitaufwändig und nur durch qualifiziertes Personal durchführbar. Deshalb entwickeln wir unter Nutzung des SELEX-Verfahrens ssDNA – Aptamere für die Sporen von Aspergillus- und Penicillium- Stämmen, die in Biosensoren für die Detektion von Schimmelpilzen in Innenräumen eingesetzt werden sollen. Beide Stämme gehören zu den häufig in Innenräumen auftretenden Schimmelpilzen, von denen bekannt ist, daß sie verschiedene Mykotoxine freisetzen. Die Gewinnung von Aptameren erfolgt unter Verwendung einer evolutionären Methode, dem SELEX-Verfahren (Systematic Evolution of Ligands by Exponential Enrichment). Dabei werden in einem Bindungsschritt aus einem Pool verschiedenster einzelsträngiger DNA-Moleküle (ss DNA) zunächst diejenigen gewonnen, die aufgrund ihrer individuellen Struktur bevorzugt an das Zielmolekül binden. Nach ihrer Ablösung von den Zielmolekülen (intakte Sporen) werden sie mittels PCR vervielfältigt. Dabei enstehen Doppelstränge, von denen die für die Bindungsreaktion an die Zielmoleküle überflüssigen Gegenstränge abgetrennt werden müssen. Dies geschieht über die Spaltung einer Ribose-Bindung im Gegenstrang, die durch modifizierter Primer eingeführt wurde. In dem auf diese Weise entstandenen Pool sind nun besser bindende ssDNA Moleküle angereichert, die für die Bindungsreaktion der nächsten Selektionsrunde zur Verfügung stehen. Dieser Prozeß wird so lange wiederholt, bis keine weitere Verbesserung der Affinität erfolgt. Die Affinität der auf diesem Wege hergestellten Aptamere wird unter Verwendung verschiedener Methoden getestet. Dazu gehören ein Standard-Filter-Bindungs-Test, eine fluoreszenz-mikroskopische Methode, die Messung der Fluoreszenzdepolarisation und die Anwendung der Resonant Mirror Spektroskopie.