Gasdialytisch-chemiluminometrische Wasserstoffperoxiddetektion : Grundlagen und Anwendung zur enzymatischen Durchflußanalyse

Abstract

Die gasdialytische Abtrennung von Wasserstoffperoxid aus wäßrigen Proben lösungen wurde unter kontinuierlichen Durchfluß - und FIA ( Flow Injection Analysis ) - Bedingungen systematisch untersucht. Dazu wurde die amperometrische und die chemiluminometrische Durchflußdetektion angewendet. Der Trennschritt führte in beiden Fällen zu einer wesentlichen Erhöhung der Selektivität. So lassen sich insbesondere die bei der chemiluminometrischen Detektion durch leicht reduzierbare Substanzen, wie z.B. NADH, Paracetamol, Harnsäure, reduziertes Glutathion und Ascorbinsäure verursachten Interferenzen vollständig bzw. zum wesentlichen Teil ausschalten. Untersucht wurde der Einfluß der Verweilzeit, der Trennzellengeometrie, der Temperatur, des pH - Wertes und der Pufferzusam-mensetzung. Als besonders aussichtsreich erwies sich die gasdialytisch – chemi-luminometrische Detektion in einem miniaturisierten und mit einem Photonen-countingsystem ausgerüsteten Detektor, mit dem bei kurzen Ansprechzeiten von T90 < 5 s Nachweisgrenzen um 0.5 mM erreicht werden. Dies ermöglicht Analysen-frequenzen von bis zu 100 Bestimmungen pro Stunde. Die Chemilumineszenz-detektion beruhte dabei entweder auf der durch Peroxidase aus Arthromyces ramosus oder durch Co(II) katalysierten Oxydation von Luminol. Die gasdialytisch – chemiluminometrische Wasserstoffperoxiddetektion wurde auf die Bestimmung von Oxidasesubstraten, wie z.B. L-Lactat, Glucose, Pyruvat und Glycerol - 3- phosphat angewendet, die dann auch in komplexen Proben-lösungen, wie z.B. in Medien von technischen Säugerzellkulturen in einem weiten Bestimmungsbereich zwischen 1 mM und 10 mM mit sehr hoher Selektivität bestimmt werden können. Die bei der Chemilumineszenzdetektion infolge Bildung hochreaktiver Intermediate sonst immer auftretenden starken Matrixeffekte, hervorgerufen insbesondere durch zahlreiche redoxaktive Substanzen aber auch durch Chelatbildner können praktisch ausgeschlossen werden.