Markierungsfreies Hochdurchsatzscreening mittels reflektometrischer Interferenzspektroskopie

Abstract

In Anbetracht der aktuellen Situation bei der Untersuchung und Entdeckung von pharmazeutisch wirksamen Substanzen war das Ziel der Arbeit eine Untersuchung der Möglichkeiten, die markierungsfreie Detektion für den Einsatz im Hochdurchsatzscreening zu nutzen und durch ein breites Angebot an Sensoroberflächen und Assay-Testformaten ein möglichst breites Anwendungsgebiet zu eröffnen. Als Detektionsmethode wurde die Reflektometrische Interferenzspektroskopie (RIfS) verwendet. Das Augenmerk lag zum einen auf der Bereitstellung und experimentellen Charakterisierung von unterschiedlichen Transduceroberflächen, Zum anderen wurde ein für High-Throughput Screening-Anwendungen vorgesehener Prototyp auf seine Eignung hin grundlegend charakterisiert und an unterschiedlichen Beispielassays seine Anwendungsbreite sowie die Grenzen aufgezeigt. Effektive Immobilisierungstechniken, zur kovalenten Immobilisierung von Biotin, (Strept?)Avidin und NTA wurden entwickelt und es wurde gezeigt, dass sich mit diesen Systemen Biotin-Konjugate bzw. His-Tag-Fusionsproteine in unterschiedlicher Dichte auf der Sensoroberfläche immobilisieren lassen, so dass kinetische und thermodynamische Untersuchungen möglich waren. Am Beispiel von drei Assays, die in die Kategorien indirekter Assay, direkter Assay und indirekter funktioneller Assay eingeordnet werden können, wurde gezeigt, dass eine Vielzahl unterschiedlicher Bindungsstudien für ein HTS auf Basis von markierungsfreier optischer Detektion geeignet sind. Untersucht wurden folgende Assays: 1. indirekter Thrombin-Inhibitor-Bindungsassay 2. direkter Assay zum Screenen einer festphasengebundenen Triazinbibliothek 3. indirekter funktioneller Epidermalwachstumsfaktorrezeptor-Inhibitor-Assay. Mit einer Kavitätendichte von 384 Kavitäten und einer Auswertezeit von unter 15 min wird die parallele RIfS den Anforderungen an Probendurchsätzen gerecht. In Zukunft wird auch eine parallele kinetische Auswertung der Daten möglich sein.

Due to the actual development in the search and characterisation of new pharmaceutical drugs, the aim of the presented work was: An evaluation of the possibilities to use label free detection methods in the field of high-throughput screening and to open a wide range of possible applications by offering different sensor surfaces and different assay formats. A prototype to detect the interaction of a receptor with a biosensor surface highly parallel and label free was available. Due to the optical set-up and due to the format of the sample carrier, this prototype was fully compatible with the demands of high-throughput screening HTS. This prototype which was developed and characterized is based on reflectometric interference spectroscopy RIfS. One of the main focuses was to characterize the high-throughput screening prototype with the help of different assay systems. An other focus was to provide and to characterize a set of different sensor surfaces which allow the side directed immobilisation of Ligand for the parallel biomolecular interaction analysis. Effective immobilisation strategies to attach biotin, (strept-)Avidin and NTA covalently onto the sensor surface was developed. With these surfaces it was able to obtain kinetic and thermodynamic data of receptor-ligand interactions. Three screening assays of different type were developed to show the wide range of applications of the set-up:

1.An indirect thrombin-inhibitor binding assay. 2. A direct assay to screen a surface bound, combinatorial triazine library. 3. An indirect functional assay to screen for inhibitors of the epidermal growth factor receptor.

With sample carriers to screen up to 384 samples in parallel and a detection time of less than 15 min was shown, that this method is suited for HTS. In the future, there will be also the possibility to evaluate the binding kinetic in parallel.