Untersuchung des molekularen Mechanismus der schnellen Regulation der DNA-Replikation an mit Alpha-Toxin aus S. aureus permeabilisierten Kulturzellen

Abstract

HeLa-Zellen können durch alpha -Toxin aus Staphylococcus aureus für niedermolekulare Substanze bis ungefähr 2 kD permeabel gemacht werden. Durch die Bereitstellung eines geeigneten Mediums kann in HeLa-Zellen, die auf diese Weise permeabilisiert wurden, Replikation stattfinden. Nach der Permabilisierung replizieren HeLa-Zellen im Vergleich zu intakten Zellen verlangsamt. Die einzelnen Schritte der Replikation – Initiation, Elongation, Termination – finden jedoch in geregeltem Ablauf wie in vivo statt. Die Replikation in permeabilisierten HeLa-Zellen kann durch Hemmung der prozessiven DNA-Polymerisation unterbunden werden. Durch Hemmung anderer biochemischer Stoffwechselwege kann jedoch kein Einfluss auf die Replikation genommen werden. Nach der Permeabilisierung ist die Replikation also nicht mehr in gleicher Weise wie in vivo regulierbar. Bei der radioaktiven Markierung von replizierender DNA in permeabilisierten HeLa-Zellen akkumuliert eine Klasse kurzkettiger Moleküle. Die Länge dieser Nukleotidketten beträgt von 16–100 Nukleotide. Es treten diskrete Größenklassen von Molekülen auf. Diese können bei verlängerter Inkubation in gereifte DNA eingebaut werden. Auch enthalten diese Moleküle einen alkalilabilen Anteil. Bei diesen Intermediaten handelt es sich wahrscheinlich um Primer der Replikation. Der Unterschied in der Regulierbarkeit zwischen intakten HeLa-Zellen und permeabilisierten Zellen konnte nicht auf direkte Effekte der Zerstörung der Zellwand zurückgeführt werden. Auch konnte unter Zuhilfenahme einer großen Zahl von in Frage kommenden Parametern keine Möglichkeit gefunden werden, diesen Unterschied aufzuheben. Das Replikationssystem der mit alpha-Toxin aus Staphyloccocus aureus permeabilisierten HeLa-Zellen ist also zur Darstellung der Replikation gut geeignet. Die Regulation ist jedoch im Vergleich zur in vivo Kontrolle verändert. Das System ist in der vorliegenden Form nicht geeignet, die Regulation der Initiation der Replikation zu untersuchen.

HeLa cells can be made permeable to substances of a molecular weight up to approximately 2 kD by means of alpha-toxin from Staphylococcus aureus. Permeabilized cells can continue replicating DNA, if the reactions are supported by the ingredients of the surrounding medium. All steps of DNA-replication can then take place in a manner very similar to those in cells in vivo. In permeabilized HeLa cells DNA-replication inhibition can be mediated by inhibition of the processive DNA-polymerization. An inhibition of the replication-reactions corresponding to the inhibition of other biochemical pathways in the cell cannot be detected. In this respect permeabilized HeLa cells do not react in the same way as HeLa cells in vivo do. When newly synthesized DNA is labeled radioactively in permeabilized HeLa cells, a class of short chain intermediates of discrete size between 16 to 100 nucleotides accumulates. All the intermediates can be integrated into genomic DNA when incubated for a longer span of time. The intermediates are characterized by an alkali-labile part. Possibly the intermediates are primers of replication. The difference appearing in regulation of the DNA-replication between permeabilized HeLa cells and HeLa cells in vivo is not caused by the permeabilization of the cell membrane itself. Even by testing a broad range of questionable parameters, the mentioned difference could not be overcome. It turned out, that the system of permeabilized HeLa cells is well suited for examining the replication in HeLa cells. The regulation of the replication differs from that in cells in vivo. Because of that the system in the presented way is not suited for examining the regulation of replication initiation in eucaryotic cells.