Inhaltszusammenfassung:
Die eukaryontische Replikation wurde mit Hilfe der Permeabilisierung durch Staphylococcus-Alphatoxin unter Verwendung des Modellsystems der DNA-Replikation des Simian Virus 40 (SV40) unter hypoxischen und normoxischen Bedingungen untersucht. Das bei Eger 1995 benutzte Kalium-Glutamat-PIPES-Puffersystem für permeabilisierte Zellen wurde weiter optimiert, um die SV40-Replikation in vivo so gut wie möglich zu imitieren. Die Nachweisverfahren für SV40-DNA-Replikationsintermediate und -produkte wurden erweitert und verfeinert, die Etablierung und Aufrechterhaltung von Hypoxie (u.a. durch Zugabe von Ascorbat, Ascorbatoxidase und NaHCO3 im 37°C-Wärmeraum) wurde verbessert.
Die erhaltenen Daten stützen folgende Feststellungen:
1. In permeabilisierten Zellen findet sowohl Prä-Initiation als auch Initiation statt.
2. Die DNA-Elongation in permeabilisierten Zellen ist der in vivo vergleichbar.
3. Der hypoxisch arretierte Zustand der SV40-DNA-Replikation in intakten Wirtszellen läßt sich sowohl durch normoxische als auch durch hypoxische Permeabilisierung hypoxischer Zellen aufheben. Durch Reoxigenierung kurz vor Permeabilisierung werden die stärksten Effekte beobachtet.
4. In hypoxischen, permeabilisierten, SV40-infizierten CV1-Zellen ist die Etablierung eines Zustands der DNA-Replikation möglich, der dem Zustand in hypoxischen, intakten, SV40-infizierten CV1-Zellen entspricht. Dies widerspricht der Hypothese, daß dCTP den hypoxisch verursachten Replikonaufstau verhindert bzw. aufhebt.
5. Zugabe verschiedener Substanzen (z.B. cAMP, Emetin) verändert die DNA-Replikation in permeabilisierten Zellen z.T. erheblich.
6. Hypoxische Zustände können durch Zugabe von Ascorbat, NaHCO3 und Ascorbatoxidase ins Permeabilisierungsmedium schneller etabliert werden als durch ausschließliche hypoxische Begasung.
7. Ohne hypoxische Begasung kann nach Zugabe von Na-Dithionit in Zellkulturmedium in vivo kein hypoxischer Zustand der DNA-Replikation etabliert werden.
Abstract:
In this work eucaryontic replication was studied using the tool of permeabilization of mammalian cells by staphylococcal alpha-toxin and that of the model system of simian virus 40 (SV40) DNA replication under hypoxic and normoxic conditions. The used buffer system for permeabilized cells, already used in Eger, 1995, was further optimized to approach in vivo conditions of SV40 DNA replication in CV1 host cells as closely as possible. The detection methods for SV40 DNA replication intermediates and products were enlarged and refined and the establishment and maintenance of hypoxia (for example by addition of ascorbic acid, ascorbate oxidase and NaHCO3 in hypoxic atmosphere and in a 37°C-temperated room) was improved.
The obtained data support the following statements:
1. Both, pre-initation and initation occur in permeabilized cells.
2. DNA elongation in permeabilized cells is comparable with DNA elongation in vivo.
3. The hypoxic arrest of SV40 DNA replication in host cells observed in vivo is released in permeabilized cells under normoxic and hypoxic conditions as well. Reoxigenation shortly before permeabilization produces the strongest effects.
4. A comperable state of viral DNA replication can be established in hypoxic intact cells as well as in hypoxic permeabilized cells. Because the dCTP pool of permeabilized cells is set to a normal level the above observation is not comperable with the hypothesis that replication initation depends on the dCTP pool.
5. Addition of some substances (e.g. cAMP, emetine) considerably influence DNA replication in permeabilized cells.
6. Addition of ascorbic acid, ascorbate oxidase and NaHCO3 to the permeabilization medium during hypoxic gassing accelerates the establishment of the hypoxic state.
7. It is not possible to establish a hypoxic state of DNA replication in vivo by addition of sodium dithionite alone without prolonged hypoxic gassing.
staphylococcus aureus , alphatoxine , simian virus 40 , cv1 cells , DNA replication