Antigen Variation: Untersuchungen zur GPI-Verankerung der varianten Oberflächenglycoproteine in Trypanosoma brucei

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URI: http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bsz:21-opus-2331
http://hdl.handle.net/10900/48154
Dokumentart: Dissertation
Date: 2001
Language: German
Faculty: 7 Mathematisch-Naturwissenschaftliche Fakultät
Department: Sonstige - Chemie und Pharmazie
Advisor: Duszenko, M.
Day of Oral Examination: 2001-02-23
DDC Classifikation: 540 - Chemistry and allied sciences
Keywords: x
Other Keywords: Variantes Oberflächenglycoprotein (VSG) , Glycosylphosohatidyl-inositol (GPI) anker , In vitro Translation , Transamidation , TbGpi8
Variant surface glycoprotein (VSG) , Glycosylphosphatidylinositol (GPI) anchor , In vitro translation , Transamidase , TbGpi8
License: xmlui.dri2xhtml.METS-1.0.item-dc-rights_value_ubt-nopod
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Inhaltszusammenfassung:

Der Parasit Trypanosoma brucei exprimiert ein variantes Oberflächen-glycoprotein (VSG), das ihn vor einer Lyse durch das Immunsystem des Wirtes schützt. Um trypanosomen-spezifische post-translationale Modifikationen von VSG zu untersuchen, wurde durch limitierte Lyse der Blutform von Trypanosoma brucei ein zell-freies System entwickelt. N-Glycosidase F, Biotin-Lysin-tRNAlys und anti-CRD Antiköper wurden für den Nachweis der N-Glycane und GPI-Anker im neu sythesierten VSG erfolgreich verwendet. Das Erscheinen von mfVSG durch Hemmung der endogenen GPI-PLC mit ZnCl2 und Markierung des VSG mit UDP-[14C]-Galactose stellen eindeutig Beweise für die Verbindung zwischen in vitro Translation und post-translationalen Modifikationen in unserem zellfreiem System dar. Dieser Tranamidase-Mechanismus der GPI-Verankerung wurde durch Kultivierung von Blutformen in Medium mit Hydrazin oder biotinyliertem Hydrazin untersucht. In Gegenwart von Hydrazin kann neu gebildetes VSG nicht vom anti-CRD Antiköper detektiert und nicht effizient an die Zelloberfläche transportiert werden; in Gegenwart von biotinyliertem Hydrazin kann neu gebildetes VSG von Streptavidin detektiert werden. Untersuchung der Trasamidase Aktivität in Zell-lysat durch Ac-S-V-L-N-AMC zeigt sich auch ein transamidase Reaktionsmechanismus und ein Sulfhydryl Rest in dem aktiven Zentrum. TbGpi8 wurde kloniert und in E. coli exprimiert. Die Homologie zwischen Gpi8 und anderen Cys- Proteinasen, z.B. Caspasen, deutet auf Cys192 und His150 als potientiellen Rest im aktiven Zentrum hin. Heterogene exprimiertes TbGpi8 führte zur Spalte des Modellsubstrate Ac-S-V-L-N-AMC. Das Ergebnis zeigt, daß TbGPI8 direkt an der proteolytischen Entfernung des C-Terminalen Peptids beteiligt ist. Die intrazellulare Lokalisation von TbGpi8 innerhalb des Golgi-Apparats wurde durch Anti-TbGpi8 Antiköper beobachtet. Western-blot Analyse zeigt 3 Proteinband von 37, 35 und 33 kDa.

Abstract:

The parasitic protozoan Trypanosoma brucei expresses a variant surface glycoprotein (VSG), which protects it from lysis by host serum components. To study trypanosome-specific post-translational modifications of VSG, a cell-free system was produced by 'limited lysis' of bloodstream forms of Trypanosoma brucei. N-glycosidase F, Biotin-lysine-tRNAlys and specific anti-CRD antibodies were used successfully to demonstrate the existence of the N-glycans and the GPI anchor on newly formed VSG. Appearance of mfVSG by inhibition of endogenous GPI-PLC with ZnCl2 and labeling of VSG with UDP-[14C]galactose provided conclusive evidences for the linkage between in vitro translation and post-translational modification in our cell free system. The transamidase mechanism of GPI anchoring was studied by culture of bloodstream form Trypanosoma brucei in media containing hydrazine or biotinylated hydrazine. In the presence of hydrazine, newly formed VSG was not detected with anti-CRD antibodies and was not transferred to the cell surface efficiently; in the presence of biotinylated hydrazine, newly formed VSG was detected by streptavidin. Study of the transamidase in lysate using Ac-S-V-L-N-AMC showed also a transamidation reaction mechanism and a functionally sulfhydryl residue in the active centre. TbGpi8 was cloned and expressed in E. coli. Like LmGpi8, TbGpi8 has no C-terminal hydrophobic region. Homology between Gpi8 and other Cys proteinases, such as caspases, pointed to Cys192 and His150 as potential active site residues. Enzyme activity assays using heterologously expressed TbGpi8 and Ac-S-V-L-N-AMC showed cleavage of the substrate, indicating that Gpi8p is indeed directly involved in the proteolytic removal of the GPI anchoring signal. Intracellular localization of the TbGpi8 within the Golgi apparatus was observed by using specific anti-TbGpi8 antibodies. Western blotting analysis demonstrated 3 protein bands of 37, 35 and 33 kDa.

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