Einsatz der Fließ-Injektions-Analyse in markierungsfreien Bindungsassays

Abstract

Im Rahmen dieser Arbeit wurde die Fließ-Injektions-Analyse (FIA) zur automatisierten Handhabung flüssiger Proben mit der Reflektometrischen Interferenz-Spektroskopie (RIfS) als markierungsfreie optische Detektionsmethode kombiniert, um biomolekulare Wechselwirkungen zu untersuchen und im analytischen Bereich anzuwenden. Zunächst wurden Antigen/Antikörper-Systeme mit Hilfe kinetischer und thermodynamischer Konstanten charakterisiert, wobei verschiedene Auswertemethoden der aus der Messung erhaltenen Bindungskurven miteinander verglichen wurden. Des weiteren wurden mit Antigen/Antikörper-Systemen Bindungshemmtests durchgeführt. Dies ist eine Art Immunoassay, mit dem u. a. Antigenkonzentrationen in wäßrigen Lösungen bestimmt werden können. Da der Arbeitsbereich bei hochaffinen Antigen/Antikörper-Systemen unter einer Größenordnung liegt, wurden mit Hilfe des FIA-Systems Bindungshemmtests mit Gradientenansatz eingesetzt, um diesen Bereich zu vergrößern. Damit konnte der Arbeitsbereich sowohl zu höheren als auch zu niedrigeren Antigenkonzentrationen hin erweitert werden: Er betrug nun bis zu drei Größenordnungen beim gleichen Antigen/Antikörper-System. Außerdem wurden Titandioxid-Oberflächen, die als Modellsystem für dentale Titan-Implantate ausgewählt wurden, durch kovalent gebundene Glykoproteine funktionalisiert. Anschließend wurde mit FIA und RIfS die Adsorption von Proteinen auf diesen biofunktionalisierten Schichten untersucht, um diese Oberflächen hinsichtlich einer späteren Verwendung als Implantatbeschichtung zu beurteilen.

Within this doctorate thesis flow injection analysis (FIA) for automated handling of liquid samples was combined with reflectometric interference spectroscopy (RIfS) as a label free optical detection method. This set-up was applied for investigating biomolecular interactions and for using these interactions in the field of analytical measurements. First antigen/antibody-systems were characterised with kinetic and thermodynamic constants, whereas different evaluation methods of the binding curves obtained from the measurements were tested. Afterwards binding inhibition assays were performed with antigen/antibody-systems. These assay type is a kind of immunoassay which enables, among other things, the determination of antigen concentrations in aqueous solutions. Since the working range using high affinity antigen/antibody-systems amounts to less than one order of magnitude, binding inhibition assays with gradient approach were performed with the FIA-system in order to enlarge this range. The working range could be increased both to higher and to lower antigen concentrations: It was now about three orders of magnitude with the same antigen/antibody-system. Furthermore titanium dioxide surfaces, which were chosen as a model system for dental titanium implants, were functionalised with covalent bound glycoproteins. Afterwards the adsorption of proteins on these biofunctionalised surfaces was investigated with FIA and RIfS for rating these surfaces regarding further applications as implant coating.