Expressionsanalyse der Zellzyklusregulatorproteine der Zyklin-, CDK-, CDKI- und Rb-Familie in humanen Chondrocyten in-vitro in Abhängigkeit von Proliferation und Differenzierung

Abstract

Ziel dieser Arbeit war es, in dem einfachen Modellsystem kultivierter humaner Chondrocyten G1-Zellzyklusregulatoren zu identifizieren, die bei der Regulation des Proliferationsverhaltens von humanen Chondrocyten eine Rolle spielen. Der Differenzierungsgrad und das Proliferationsverhalten von humanen Chondrocyten lässt sich in-vitro durch unterschiedliche Dauer der Subkultivierung (Passagenzahl) und unterschiedliche Kulturbedingungen beeinflussen. Es wurde das Expressionsmuster der Zykline A, D1 und E, der Zyklinabhängigen-Kinasen 2, 4, und 6 und deren Inhibitoren der INK4 und CIP/KIP-Familie, sowie die Rb-Familie auf Protein- und RNA-Ebene in humanen Chondrocyten unterschiedlicher Kulturpassagen, sowie unter unterschiedlichen Kulturbedingungen untersucht. Es konnten differenzierungsabhängige Unterschiede in der Expression der Zyklinabhängigen-Kinaseinhibitoren der INK4-Familie (p15INK4b, p16INK4a) und der CIP/KIP-Familie (p57KIP2) gezeigt werden, die sich in einer Zunahme der Expression dieser Inhibitorproteine von frühen (Passage 2) zu späten (Passage 8) Kulturpassagen, sowie bei Entzug von Serummitogenen manifestierten. Interessanterweise gehen beide Phänomene (Zunahme der Kulturpassagenzahl und Entzug von Serummitogenen) mit einer Abnahme der Proliferationsfähigkeit der humanen Chondrocyten einher. Das heisst, die reduzierte Proliferationsf higkeit könnte durch die Hochregulation dieser Zellzyklusregulatoren bedingt sein. Diese Ergebnisse zeigen damit zum ersten Mal, dass die Zyklinabhängigen-Kinaseinhibitoren p15INK4b, p16INK4a und p57KIP2 eine Rolle bei der Kontrolle des Differenzierungsgrades und des Proliferationsverhaltens humaner Chondrocyten einnehmen könnten.

Eucaryotic cell cycles are controlled by the activities of cyclin dependent kinases (CDKs), cyclins and CDK-inhibitors (CDKIs). These regulators play a major role in the control of proliferation and differentiation in cultured cells and during mammalian tissue development. Using ribonuclease protection assays and immunohistochemical staining methods we analyzed expression profiles of the of the G1 cell-cycle regulators of the CDKs, the cyclins, the CDKIs and the Retinoblastoma protein-family in proliferating, quiescent and senescent states of cultured human chondrocytes. We observed an upregulation of the CDKIs p15INK4b, p16INK4a and p57KIP2 from early (passage 2) to late (passage 8) culture stages and an upregulation of the CDKIs p15INK4b and p57KIP2 after serum withdrawal in passage 2 on protein and mRNA level that both correlated with decreasing proliferation rates. Our data for the first time show a correlation of the expression of p15INK4b, p16INK4a and p57KIP2 with proliferation and differentiation in cultured human chondrocytes. Therefore these CDKIs may serve as candidate therapeutic agents that could allow controlled in-vitro cultures of human chondrocytes beyond the limitations of quiescence and senescence.