Molekularbiologische und biochemische Untersuchungen zur Biosynthese von Novobiocin in Streptomyces spheroides NCIMB 11891

Abstract

Das Aminocumarin-Antibiotikum Novobiocin gehört zur Gruppe der DNA-Gyrase-Inhibitoren und wird durch Streptomyces spheroides produziert. In den Vereinigten Staaten ist Novobiocin (Albamycin®, Pharmacia & Upjohn) als Antibiotikum zur Behandlung von Infektionen mit multiresistenten, Gram-positiven Bakterien zugelassen. Die Erforschung der Novobiocin-Biosynthese auf molekularbiologischer Ebene und die Charakterisierung der beteiligten Enzyme könnte ein nützliches Mittel zur Entwicklung neuer anti-infektiver Substanzen darstellen. Im ersten Teil dieser Arbeit wurde eine Dimethylallyldiposphat:4-Hydroxyphenylpyruvat Dimethylallyltransferase, die sehr wahrscheinlich an der Biosynthese von Novobiocin beteiligt ist, in S. spheroides identifiziert, partiell gereinigt und charakterisiert. Das Enzym war löslich und spezifisch für die Substrate 4-Hydroxyphenylpyruvat und Dimethylallyldiphosphat. Das Novobiocin-Biosynthese-Cluster aus S. spheroides NCIMB 11891 wurde durch Screening mit homologen dNDP-Glucose-4,6-Dehydratase Sonden kloniert. In dieser Arbeit konnte nach Sequenz-Analyse von 53,1 kb 42 offene Leserahmen (ORFs) identifiziert werden. 14 ORFs konnte eine mögliche Rolle innerhalb der Novobiocin-Biosynthese zugeordnet werden. Die Klonierung und Expression eines Schlüsselenzyms der Novobiocin-Biosynthese, der Novobiocinsäure-Synthetase, bestätigte die Beteiligung der untersuchten Gene an der Biosynthese des Antibiotiums. Das Protein wurde als His6 Fusionsprotein in Escherichia coli überexprimiert und mittels Affinitäts-Chromatographie und Gelfiltration bis zur annähernden Homogenität gereinigt. Das gereinigte Enzym katalysierte die ATP-abhängige Bildung der Amidbindung zwischen 3-Dimethylallyl-4-hydroxybenzoesäure und 3-Amino-4,7-dihydroxy-8-methylcumarin.

The aminocoumarin antibiotic novobiocin belongs to the DNA gyrase inhibiting agents and is produced by Streptomyces spheroides. In the United States novobiocin (Albamycin®, Pharmacia & Upjohn) is licensed as an antibiotic for the treatment of infections with multiresistent gram-positive bacteria. Discovery of the genetic basis of the biosynthesis of novobiocin and characterization of the corresponding enzymes could provide a useful tool for development of new anti-infective agents by combinatorial biosynthesis. In the first part of this work, a dimethylallyl diphosphate:4-hydroxyphenylpyruvate dimethylallyl transferase, which is most likely involved in the biosynthesis of the prenylated 4-hydroxybenzoate moiety, was identified in S. spheroides, partially purified and characterized. The enzyme was soluble, and specific for 4-hydroxyphenylpyruvate and dimethylallyl diphosphate as substrates. The novobiocin biosynthetic gene cluster from S. spheroides NCIMB 11891 was previously cloned by using homologous deoxynucleoside diphosphate (dNDP)-glucose 4,6-dehydratase gene fragments as probes. In this work, sequence analysis of a 53.1 kb of this region revealed the presence of 42 putative open reading frames (ORFs). Possible roles of 14 ORFs could be assigned to novobiocin biosynthesis. Cloning and expression of a key enzyme of novobiocin biosynthesis, i.e. novobiocic acid synthetase confirmed the involvement of the analyzed genes in the biosynthesis of the antibiotic. The protein was overexpressed as a His6 fusion protein in Escherichia coli and purified to apparent homogeneity by affinitiy chromatography and gel filtration. The purified enzyme catalyzed the formation of an amide bond between 3-dimethylallyl-4-hydroxybenzoic acid (= ring A of novobiocin) and 3-amino-4,7-dihydroxy-8-methyl coumarin (= ring B of novobiocin) in an ATP-dependent reaction.