Neue Marker und ihr diagnostischer Einsatz bei pathomolekularen Veränderungen am Chromosom 22

Abstract

Obwohl die Aufschlüsselung der gesamten Sequenz des menschlichen Genoms mittlerweile fast erreicht ist, gibt es nachwievor Bereiche, die noch nicht ausreichend charakterisiert sind, wie z.B. die Übergangsregionen zwischen hetero- und euchromatischer DNA an Centromeren und Telomeren. Der erste Teil der Dissertation beschäftigt sich mit der Charakterisierung des Hetero-Euchromatin-Übergangs am Centromer von Chromosom 22. Ein dort lokalisierter BAC-Contig wurde mithilfe des Exon Trappings nach exprimierten Sequenzen durchsucht. Es konnten zwei Exonkandidaten identifiziert werden, deren ubiquitäre Expression in menschlichen Geweben darauf hinweist, daß sie als Teile von Haushaltsgenen oder konservierten Strukturgenen vorliegen. Für einen Exonklon wurde eine cDNA isoliert, von der 2005 bp des Inserts gelesen werden konnten. Ausführliche Abgleiche der Sequenzen ergaben keinerlei Homologie zu bekannten Gen- oder Proteinmotiven, was bedeutet, daß es sich hierbei um ein neues Gen handelt. Die Lokalisation des cDNA-Klons in dem pericentrischen Contig von Chromosom 22 bestätigt die Tatsache, daß es sich hierbei um die proximalste exprimierte Sequenz handelt, die bisher gefunden wurde. Im zweiten Teil der Arbeit wurden umfangreiche Sets von geeigneten BAC-Rekombinanten aus klinisch relevanten Regionen von Chromosom 22 zusammengestellt und auf ihre Anwendbarkeit in FISH-Experimenten überprüft. Auf diese Weise standen präzise lokalisierte BAC-Rekombinanten der Regionen 22q11, q12 und q13 als Sonden zur Verfügung, um sie in klinisch-diagnostischen Fragestellungen einzusetzen. Die effiziente Anwendung dieser Sets wurde anhand 5 verschiedener Fälle pathologischer Aberrationen des Chromosoms 22 bewiesen. Bruchpunkte konnten eingegrenzt und Ausmaße der Rearrangements bestimmt werden. Dieser Teil der Arbeit stellt eine wichtige Grundlage für klinische Fragestellungen bezüglich Chromosom 22 dar, da sie das Handwerkzeug für eine präzise Diagnostik liefert.

The main goal of the human genome project, the identification of the whole human sequence, is almost reached, but still there are several regions not sufficiently characterized, e.g. the transitions between hetero- and euchromatic DNA at centromeres and telomeres. Therefore, the first part of this project deals with the characterization of the transition region between the hetero- and euchromatin at the centromere of chromosome 22. Using exon trapping experiments a BAC contig was screened for expressed sequences and two candidates were identified. They show an ubiquitous expression pattern in human tissues indicating them being part of housekeeping genes or conserved structural genes. For one of the exon candidates a cDNA clone was isolated and 2005 bp of the insert were sequenced. Screening public databases no homologies to known genes or protein motives could be found. Thus, this cDNA sequence must be part of a new gene. The localization of the cDNA clone within the pericentric BAC contig is proving the fact that this new sequence is the most proximal gene found on chromosome 22 q-arm to date. In the second part of the project sets of useful BAC recombinants were collected for clinically relevant regions on chromosome 22 and applicated in FISH experiments. As a result, precisely localized BACs were found which can be used as probes for the chromosomal regions 22q11, q12 and q13 analyzing clinical cases. The efficient application of these probe sets was tested successfully in 5 patients carrying different pathological aberrations on chromosome 22. Breakpoints as well as extents of rearrangements were determined. Hence, these data prove the importance of this probe sets as an excellent tool for precise, clinical diagnostic on chromosome 22.