Etablierung und Charakterisierung eines pseudotypisierten retroviralen Gentransfer-Systems mit Selektivität für den Hepatocyten-spezifisch exprimierten Asialoglycoprotein-Rezeptor

Abstract

Ansätze zum therapeutischen in vivo Lebergentransfer erfordern leberrestringierte Gentransfersysteme. Die derzeit verwendeten amphotropen Moloney Murine Leukemia Virus (MoMLV)- Vektoren sind aufgrund ihres breiten Transduktionsspektrums für in vivo Applikationen nicht geeignet. In diesem Zusammenhang wurde die Möglichkeit der Pseudotypbildung zwischen ecotropem MoMLV und Sendai Virus (SeV), einem Parainfluenzavirus, untersucht. Der Einbau beider SeV- Hüllproteine (HN und F) in die retrovirale Hülle führt zu einer starkenErweiterung des Transduktionsspektrums aufgrund der Interaktion von HN mit den ubiquitär vorkommenden SeV- Rezeptoren. Dagegen führt der alleinige Einbau des SeV-F Proteins zu einer sehr spezifischen Erweiterung desTransduktionsspektrums auf Asialoglycoprotein-Rezeptor (ASGP-R) positive Zellen. Diese Spezifität konnte zum einen durch Transduktion der ASGP-R positiven humanen Hepatomzellinien HepG2 und HuH7 gezeigt werden, wohingegen Zellinien, die weder den ASGP-R noch den ecotropen Rezeptor exprimieren (z. B. BHK), einer Transduktion durch MoMLV(SeV-F)-Pseudotypen nicht zugänglich waren. Zum anderen konnte ein direkter Nachweis der Pseudotypspezifität durch Transduktion von stabil mit der ASGP-R cDNA transfizierten MDCK-Zellen (M12) geführt werden, wobei diese ASGP-R abhängige Transduktion durch ASGP-R Antikörper hemmbar war. ASGP-R negative Ausgangszellen (MDCK) hingegen ließen sich nicht transduzieren. Durchflußtransduktionen der ASGP- R positiven Zelllinie HepG2 ergaben eine signifikante Erhöhung der MoMLV(SeV-F) Pseudotyptiter, was verdeutlicht, daß die Effizienz der MoMLV(SeV-F) Pseudotyptransduktion stark von der Zugänglichkeit des hauptsächlich auf dem basolateralen Teil der Zellmembran lokalisierten ASGP-R abhängig ist. Die jetzt zur Verfügung stehenden ASGP-R spezifischen MoMLV(SeV-F) Pseudotypvektoren eröffnen neue Möglichkeiten für den leberrestringierten in vivo Gentransfer.

Liver-restricted gene transfer systems are required for strategies to establish therapeutic in vivo liver-gene therapy protocols. Due to their broad tissue spectrum, standard Moloney murine leukemia virus (MoMLV) apmphotropic retroviral vectors cannot be used for tissue-specific in vivo applications. In this context, generation of retroviral pseudotypes via incorporation of surface proteins of a murine parainfluenza virus - Sendai virus (SeV) - in the envelope of ecotropic retroviruses was investigated. Initial experiments revealed that both Sendai virus surface proteins (HN and F) can be incorporated simultaneously into the retroviral envelope. The resulting retroviral pseudotypes exhibit a broad host range due to the interaction of HN with the ubiquitous occurring SeV-receptors. In contrast, solitary incorporation of the SeV-F protein resulted in a distinct and narrow extension of the MoMLV host range to asialoglycoprotein receptor (ASGP-R) positive cells. This specificity could be demonstrated by transduction of ASGP- R positive human hepatoma cell lines HepG2 and HuH7, whereas cells which neither express the ASGP-R nor the ecotropic receptor (e. g. cell line BHK) remained untransduced. Since stably ASGP- R cDNA transfected MDCK cells (M12) were susceptible to MoMLV(SeV-F) pseudotype transduction and this transduction was inhibited by ASGP-R specific antibodies, a direct proof for the ASGP-R restricted tropism of MoMLV(SeV-F) pseudotypes was provided. In contrast, parental ASGP-R negative MDCK cells were not transduced by MoMLV(SeV-F) pseudotypes. Flow-through transductions of ASGP-R positive HepG2 cells led to a significant enhancement of MoMLV(SeV-F) titers thereby indicating the importance of ASGP-R accessiblity at the basolateral domain for MoMLV(SeV-F) pseudotype transduction. The established MoMLV(SeV-F) pseudotype vectors open up new possibilities for liver-restricted in vivo gene therapy treatment.