Molekulare Mechanismen der Inhibition TGF-beta-induzierter Apoptose in Hepatomzellen

Abstract

Diese Arbeit beschäftigte sich mit der Aufgabe, einen eventuell existierenden, universellen Angriffspunkt der antiapoptotischen Wirkung von Tumorpromotoren und anderen Substanzen zu finden. In dieser Arbeit wurden die beiden bekannten Tumorpromotoren Phenobarbital und Dieldrin untersucht. Daneben wurden die Hormone Dexamethason und Insulin als Vertreter antiapoptotisch aktiver Substanzen, von denen kein tumorpromovierender Effekt bekannt war, in die Untersuchung aufgenommen. Als biologisches Modell zur Untersuchung der molekularen Mechanismen der anti-apoptotischen Effekte dieser Substanzen wurde die TGF-beta-induzierte Apoptose von FTO-2B-Rattenhepatomzellen gewählt. Im einzelnen wurden folgende Ergebnisse erzielt: Alle vier untersuchten Substanzen zeigten eine antiapoptotische Wirkung. Diese Wirkung kann nicht auf eine Synchronisierung der Zellen zurückgeführt werden, da alle Verbindungen nur einen geringfügigen Einfluß auf die Zellzyklusverteilung ausübten. Bis auf Insulin war keine der getesteten Verbindungen in der Lage, die TGF-beta-spezifische, Smad-Protein-vermittelte, transkriptionelle Aktivierung eines Reportergenkonstrukts zu inhibieren. Zumindest für die drei anderen Substanzen gilt deshalb, daß ihr Eingriff in den apoptotischen TGF-beta-Signalweg vermutlich erst im Anschluß an die transkriptionelle Smad-Aktivität erfolgt. Mit Ausnahme von Insulin führte keine der untersuchten Verbindungen zu einer Aktivierung der Proteinkinasen ERK1 und -2, JNK und Akt/PKB. Die Insulin-vermittelte Aktivierung von ERK1/2 könnte die bei dieser Verbindung beobachtete Hemmung der Smad-vermittelten Transkription erklären, die Aktivierung von Akt/PKB dessen antiapoptotische Wirkung. Einzig Dexamethason bewirkte eine gesteigerte Expression des antiapoptotischen Bcl-2-Proteins Bcl-xL, was seine Apoptose-suppressive Wirkung erklären könnte. Die Expression des proapoptotischen Bax-Proteins wurde von keiner Substanz beeinflußt.

The aim of this study was to elucidate a universal mechanism by which tumor promoters and other agents inhibit apoptosis. Phenobarbital and dieldrin, known tumor promoters, as well as the hormones dexamethasone and insulin, both of which have known anti-apoptotic but no known tumor promoting activity, were chosen for this task. TGF-beta-induced apoptosis of FTO-2B rat hepatoma cells served as the biological system to study the underlying molecular mechanisms. The following results were obtained: All four substances exhibited an anti-apoptotic activity. Cell synchronization is not responsible for the anti-apoptotic activities of these agents as only a slight effect was observed on the cell cycle distribution. Only insulin inhibited the TGF-beta-specific, Smad protein-mediated, transcriptional activation of a luciferase reporter gene. For this reason it can be assumed that the other three substances influence the TGF-beta mediated apoptosis downstream of Smad protein mediated transcriptional activation of primary target genes. Only insulin led to an increased activity of the protein kinases ERK1/2, JNK and Akt/PKB. The increased activity of ERK1/2 could explain the inhibition of Smad protein mediated transcriptional activity, whereas elevated Akt/PKB activity could be responsible for the anti-apoptotic activity of insulin. Only dexamethasone increased the expression of the anti-apoptotic Bcl-2 protein Bcl-xL, possibly contributing to its anti-apoptotic activity. None of the four substances influenced the expression of the pro-apoptotic Bcl-2 protein Bax. The mechanism of the anti-apoptotic activity of phenobarbital or dieldrin remains to be elucidated but protection against apoptosis-associated damage of mitochondria doesn't seem to be essential as TGF-beta induced apoptosis of FTO-2B is not associated with a release of cytochrome c from mitochondria to the cytosol. Should a common mechanism exist by which tumor promopromoting activity,