Glutathionreduktase: Reinigung aus Gehirn, Lokalisierung des Enzyms in neuralen Zellen und Suche nach gewebsspezifischen Isoformen

Abstract

Über die Glutathionreduktase (GR) des Gehirns ist nur wenig bekannt, ihre Funktion ist aber essentiell zur Erhaltung des hohen Verhältnisses [GSH]/[GSSG] in Gehirnzellen. Deshalb sollte GR aus Hirn gereinigt, enzymatisch charakterisiert, in verschiedenen Hirnzelltypen untersucht und nach Isoformen dieses Enzyms gesucht werden. GR wurde aus Rinderhirn zur Homogenität gereinigt. Das dimere Enzym besaß eine spezifische Aktivität von 145 U/mg Protein und eine Molekülmasse der Untereinheiten von 54 kDa. Neben der GR wurde das cytosolische Malatenzym zur Homogenität gereinigt, das eine spezifischen Aktivität von 40 U/mg hatte. Die Molekülmasse der Untereinheiten beträgt 64 kDa. Mit dem Reinigungsschema, das für die GR aus Rinderhirn entwickelt wurde, ließen sich auch die GR aus Rinderleber und -modifiziert- die GR aus Rindererythrocyten reinigen. Die spezifische Aktivität für die gereinigte GR aus Leber betrug 147 U/mg, für die GR aus den Erythrocyten 114 U/mg. Die Präsenz der GR in astroglia-reichen und neuronen-reichen Primärkulturen wurde durch Nachweis der spezifischen Aktivität gezeigt. Gegen die aus Rinderhirn gereinigte GR wurde ein Antiserum gewonnen, das geeignet war, das Enzym spezifisch durch Immunoblot-Experimente und immuncytochemische Anfärbungen in neuralen Zellen nachzuweisen. Immuncytochemische Doppelanfärbungen neuraler Kulturen gegen GR und zelltypspezifische Marker identifizierten Microglia-, Oligodendrogliazellen und Neuronen als deutlich GR enthaltende Zelltypen. Astrogliazellen wiesen nur schwache Immunreaktivität für GR auf. Mit mehreren proteinanalytischen und immunologischen Methoden wurde versucht, Unterschiede zwischen den gereinigten GR aus Rinderhirn,- leber und -erythrocyten festzustellen. Dabei erwiesen sich die drei Enzyme als äußerst ähnlich. Nur die massenspektrometrische Analyse tryptischer Peptide der GR aus Gehirn und Leber läßt auf Unterschiede dieser Enzyme und somit auf Isofomen schließen.

Little is known about glutathione reductase (GR) from brain, although its function is essential for the maintenance of the high [GSH]/[GSSG] ratio in brain cells. Therefore the following tasks were to be performed: purification from bovine brain, enzymatic characterization, generation of an antiserum and its use for localizing GR in different types of brain cells and search for tissue specific isoforms. The homodimer GR was purified from bovine brain to homogeneity with a specific activity of 145 U/mg of protein and an apparent molecular mass of the subunit of 55 kDa. Simultaneously with GR the cytosolic homotetrameric isoform of malic enzyme was isolated with a specific activity of 40 U/mg of protein and a subunit molecular mass of 64 kDa. In the same way as GR from brain GR from bovine liver was also isolated and with a modificated method also the GR from ox erythrocytes. The specific activites were 147 U/mg and 114 U/mg for the liver and erythrocytes enzymes, respectively. In astroglia-rich and neuron-rich primary cultures from rat brain the presence of the GR was demonstrated by determination of similar specific activities. An antiserum generated against the purified brain enzmye was used for detection of GR in immunoblots and for double-labelling immunocytochemical staining of cultured neural cells. These stainings for GR and cellular markers showed that neurons, microglial cells and oligodendroglial cells strongly express GR, whereas astroglial cells were only weakly stained. Using protein analytical and immunological methods it was difficult to detect differences between the GR preperation from bovine brain, liver and erythrocytes. However mass spectrometric analysis of tryptic peptides of GR from brain and liver detected differences, which could point to the existence of isoforms.